【求助】2-DE和质谱后，差异蛋白的进一步验证？

最新回复

• 98776langtao (2014-4-09 16:31:20)

  
  Western-blot比较直观，而且如果能买到相应抗体的话，验证也很快，可信度也比较高！（不过抗体一般价格不菲）
  RT-PCR个人认为没有Western-blot好，验证差异也不是特别明确。

• 小糖块 (2014-4-09 16:31:39)

  
  一般通过质谱鉴定出蛋白以后，还不能就此认定所鉴定的蛋白质就一定是有意义的差异蛋白，严谨的是要做验证的。目前好像用Western-blot是一种比较敏感的方法。如果说蛋白有在组织中的表达，也可以做免疫组化来验证吧，但是敏感性不如前者好。
  但是看 国内某些单位，跑完2-D之后就发文章了，意义究竟如何，不敢妄下结论。

• #甜# (2014-4-09 16:32:02)

  肯定是RT-PCR便宜了，但是WB更有说服力！

• luoliqiong (2014-4-09 16:32:21)

  
  谢谢大家！
  我也看到有一些文章做完双响，对差异蛋白进行质谱鉴定后就发表文章了，但有些又做了WB或是RT-PCR,所以不知道哪种情况下需要做？

• fei1226com (2014-4-09 16:33:20)

  谢谢大家！
  我也看到有一些文章做完双响，对差异蛋白进行质谱鉴定后就发表文章了，但有些又做了WB或是RT-PCR,所以不知道哪种情况下需要做？
  
  =============================================================================================================
  
  无论是国内的文章，还是国外的文章，从科研的严谨性来说，都是要对差异点进行验证的。
  一般来说，WB验证时特异而必需的。因为，通过软件分析出差异点后，蛋白点会经过切胶，酶解，点板，质谱等操作，得到的肽段与数据库进行比较，选择肽段吻合率最多的认为即是此蛋白。但其中哪一步出错，都会导致最后结论的偏差。因此，需应用特异性的抗体，将这种差异进一步证实，才更有说服力。
  至于RT-PCR验证，是可有可无的。如果核酸水平与蛋白水平又一致的改变，那可以使你的结果锦上添花，如果核酸水平无变化，你反而还要花力气去研究其原因，或给出解释。
  毕竟2DE是研究蛋白水平的，你也只需给以相应蛋白水平的验证即可。

• 831226 (2014-4-09 16:33:41)

  
  请教楼上各位，做western的话，是跑完了双向电泳以后的胶直接转到膜上做免疫印迹，还是重新从组织提蛋白再做western? 再从组织提蛋白的话，以前提了做2D的蛋白能不能加了SDS以后做western?

• luoliqiong (2014-4-09 16:34:00)

  但是，我找出那么多的差异点，都需要进行WB验证吗？验证一种蛋白就需要一种抗体，那成本有多高啊。

• fei1226com (2014-4-09 16:34:32)

  QUOTE:

  原帖由 831226 于 2014-4-9 16:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  请教楼上各位，做western的话，是跑完了双向电泳以后的胶直接转到膜上做免疫印迹，还是重新从组织提蛋白再做western? 再从组织提蛋白的话，以前提了做2D的蛋白能不能加了SDS以后做western? ...

  如果能直接用2D胶转膜，当然是最理想的方法，现在也有这么做的，叫2D blot。
  但是，7cm或11cm的小胶还好一些，如果是18cm或24cm的大胶，不仅需要非常大的膜，非常大的转膜仪，还费很多抗体和发光液。当然，如果你可以不染色就明确知道待测蛋白点的位置，可以切胶后再转膜。
  目前，重新提蛋白做western的方法是被广泛接受和认可的。以前提了做2D的蛋白加了SDS以后做western是完全可以的。

• fei1226com (2014-4-09 16:38:57)

  QUOTE:

  原帖由 luoliqiong 于 2014-4-9 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  但是，我找出那么多的差异点，都需要进行WB验证吗？验证一种蛋白就需要一种抗体，那成本有多高啊。

  找到差异点后如何做，是很多做蛋白质组学的人的困惑。
  我想你不可能把所有差异点都继续往深入做下去吧。那么从其中选择一个或几个最相关的蛋白，用western验证后，深入做机制研究。
  如果你只是止步于发现差异蛋白，而不往下做了，那么做质谱鉴定就可以了。

• luoliqiong (2014-4-09 16:39:54)

  
  谢谢哦！看来我是得选几个做WB验证了，只是很愁抗体，太贵了，还有怎么选抗体对我来说也是一个难题

• JK.jon (2014-4-09 16:40:12)

  
  你可以用做完2D剩下的蛋白质做WB.选做进一步验证的，一般还是要先查看文章，看别人做过没？在自己的研究的方向的意义如何？

• JK.jon (2014-4-09 16:41:16)

  
  楼主的这个问题，小弟我也被困扰着。
  请问各位高手，在找到差异蛋白后，这个后续的方向都有哪些呢？
  先谢了..

• niangao1980 (2014-4-09 16:41:37)

  
  这个问题也是我要做的，也查了不少的相关资料，如果只是要验证有没有差异蛋白的话，用ＷＢ就够了，但是要在细胞中去定位差异蛋白的话就要用免疫荧光的方法了．

• luoliqiong (2014-4-09 16:41:58)

  
  看来很多人都想知道 找到差异蛋白后的后续分析，希望大家能提出自己的看法。