【求助】PCR鉴定正确的转化子为何没有蛋白表达？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-09 16:51 作者: rxcc33 来源: 分析测试百科网

小弟最近做一个脂肪酶的表达。
载体：PPIC9k。目的蛋白1400左右。重组质粒测序一切正常。SalI线性化后电转入GS115。挑斑鉴定后，PCR图如下。应该是整合到酵母基因中了。
然后我没有鉴定表型，直接按照Mut＋型（在MM培养基中）和Muts型（在BMGY中）分别进行诱导。每24h加一次甲醇，到终浓度1％（最后可能会稍微大于1％）。诱导96h后，测酶活并跑蛋白电泳。另外，我预培养的BMGY、MM、BMMY培养基都没有添加磷酸缓冲液。当诱导到36h后，我才补充的磷酸缓冲液。
发现：没有酶活。蛋白电泳无新增条带。
请问各位战友这是为什么？
会不会是甲醇浓度太大，导致蛋白失活并离心沉淀？会不会是阅读框出现偏倚（我查过了，好像正常啊）？会不会磷酸缓冲液加的太晚，导致菌液pH发生变化并使蛋白沉淀？
请各位战友指教啊！！小弟急啊！！
谢谢拉！！！
从左到右依次为marker，阳性转化子，9k空质粒对照

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【求助】PCR鉴定正确的转化子为何没有蛋白表达？

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rxcc33 (2014-4-09 16:52:31)

电泳跑弯了，见笑了。
marker中比鉴定条带大的那一个为2500的条带

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yueban-1147 (2014-4-09 16:53:17)

酵母比较难做,一般PCR鉴定有,也不一定表达啊,就我做的情况来说,Muts比Mut+好,换菌试试吧你,还有你WESTERN鉴定了没?
66小飞侠 (2014-4-09 16:53:46)

PCR鉴定结果不能完全证明是阳性结果。可以采用酶切鉴定，最好是选择在插入片段中有酶切位点的酶。
rxcc33 (2014-4-09 16:54:23)

QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2014-4-9 16:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

酵母比较难做,一般PCR鉴定有,也不一定表达啊,就我做的情况来说,Muts比Mut+好,换菌试试吧你,还有你WESTERN鉴定了没?
没有做western，只是做的SDS蛋白电泳，烤马斯亮蓝染色，与空质粒比无多增条带。
rxcc33 (2014-4-09 16:54:47)

QUOTE:
原帖由 66小飞侠 于 2014-4-9 16:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

PCR鉴定结果不能完全证明是阳性结果。可以采用酶切鉴定，最好是选择在插入片段中有酶切位点的酶。
酶切什么？提取转化子的基因组酶切？那应该出来多少大小的条带呢？
请指教，谢谢！！
rxcc33 (2014-4-09 16:56:11)

还有，为什么我诱导过程中没有酵母的香甜味，反而有一定的浓重的味道。是不是甲醇加的太多了？
rxcc33 (2014-4-09 16:56:40)

啊。那我刚开始培养的是有一股酵母的味道，比较酸甜的啊。。难道我的GS115有问题？
yychen (2014-4-09 16:57:39)

QUOTE:
原帖由 rxcc33 于 2014-4-9 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
啊。那我刚开始培养的是有一股酵母的味道，比较酸甜的啊。。难道我的GS115有问题？

建议你可以通过cnki得硕博全文找一些论文关于pichia酵母表达外源蛋白得看一下，完整得了解一下这个系统得特点。
类似你说得“”酸甜这个概念，应该是从别得战友或者网站上知道得，但是每个人得感觉都是不一样得，我个人感觉在发酵过程中并没有这种酸甜得感觉。所以你也不一定拘泥于是否有这种带有主观特征得鉴定标准。尽可能利用比较客观得标准进行检测。
rxcc33 (2014-4-09 17:00:18)

前几天转化了一批。今天跑电泳测酶活！
同时又表达了一批。严格按照手册做法。
KM71H还没求到。买的话太贵。实验不顺利，不好意思找老板花钱。