【求助】超滤浓缩后的蛋白进行SDS-PAGE上样后...

最新回复

• plaa (2014-4-12 10:10:32)

  
  个人认为没有条带一般就是样品中的蛋白量有问题，但是应该不是太高而是太低。或者你的目的蛋白是小分子量蛋白，跑出去了也有可能；还有一种可能就是分子量太大沉积在上样孔中。
  至于电压的问题，如果是样品浓度很低，自然很难带上电荷（SDS处理的目的）。所以只有加大电压才能跑下去。

• junhun (2014-4-12 10:10:54)

  
  谢谢楼上的帮助，1：我目的蛋白分子量是60KDa，应该是不会跑出去的吧；
  2：蛋白是超滤过的应该就是浓缩后的啊！应该浓度高啊，我加水稀释的时候明显能看见那种高浓度加水的变化，我要是不稀释直接与样品缓冲液混合煮沸后上样也是条带不下移，难道会是脱盐没有脱干净（按理来说应该不会我超离了6000r/min、30min）；
  3：如果要是蛋白沉淀在上样孔中的话那怎么办呢？
  同时我发现我上样时里面好象是有沉淀，因为颜色有点发白，不那么蓝，能不能是蛋白的溶解性不好呢？

• langlang (2014-4-12 10:11:18)

  
  80V电压时样品不向下迁移，将电压加到120V时条带下移
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  这可能是浓缩胶的配置问题吧。
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  我加水稀释的时候明显能看见那种高浓度加水的变化
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  我曾经加水西式过不含蛋白的纯裂解液，看的的情况可能和你的一样
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  我目的蛋白分子量是60KDa
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  个人建议，用标准蛋白如牛血清白蛋白之类的已知蛋白配制样品液，试一下你的凝胶，是不是会出现上述类似的状况。若是状况相同，证明是凝胶的问题。但是溴酚蓝没有跑出，那么60k的蛋白一般会在，所以没有显示可能是上样量的问题吧。

• junhun (2014-4-12 10:11:40)

  在跑我超滤样品的同时我也跑了其他的样品（不是超滤的），MARKER我点中间了一侧是以前跑过的其他样品，另一侧是超滤后的样品，结果其他的样品（不是超滤的）一起正常，MARKER出来的也正常，其他样品在加80V电压的时候就都压下来了，可是我超滤后的样品不下移，只有加到120V时才下移，但最后那一侧超滤的样品面是白板什么都没有出来。
  这个问题很是让我郁闷啊！本以为用了超滤会很好呢，哎，真是不知道哪个环节出问题了。

• huifeng0516 (2014-4-12 10:12:03)

  个人的惨痛经验：：
  曾经我收集到2.2mg的蛋白，但是由于要免疫兔子，所以用超滤管进行浓缩，结果收集到不到1ml的浓缩样品，，测蛋白含量仅剩367ug,气愤啊！！
  建议：
  －－－－－－－－－－－我将我的含有高盐的稀蛋白溶液用MILLIPORE的处理量为15ml的超离管进行脱盐并浓缩，6000r/min、30min处理后我可收集到不到1ml的浓缩样品－－－－－－－－－－
  测蛋白含量！！！
  

• fei1226com (2014-4-12 10:13:54)

  
  在我看来是应该属于的样品处理不到位，你跑其它样品及MARKER都正常，就能很好证明这一点，而且你自己也说样品上样时里面好象是有沉淀，因为颜色有点发白，不那么蓝，应该是有东西干扰造成的，这样SDS和蛋白质结合估计受到影响，那么应该想办法解决这一可能存在的原因。从你的超滤过程来看存在一定问题，你的高盐样品直接浓缩，盐不但不能除去，反而可能会更浓，只有加水或低离子buffer多次置换后方能达到脱盐目的。电泳时高盐会就会影响SDS单体和蛋白质的结合，那么你的蛋白所带电荷不足，所以就感觉跑不动。解决办法就是超滤时多置换一下，或者透析后再直接浓缩。

• junhun (2014-4-12 10:16:13)

  
  谢谢大家的建议，十分感谢。蛋白浓度我会测一下看看的；
  bluejfy战友提到的：
  1、上样时里面好象是有沉淀，因为颜色有点发白，不那么蓝，应该是有东西干扰造成的，这样SDS和蛋白质结合估计受到影响，那么应该想办法解决这一可能存在的原因。 那这个问题我应该怎么解决呢？
  2、提到的超滤时，我用的截流是10KDa的膜，盐应该也出去了吧？脱盐和浓缩不能一起吗？？
  3、 对于超滤时多置换---是不是我超滤一次后在里面在加些水然后继续超滤，多重复几次呢？

• fei1226com (2014-4-12 10:17:21)

  
  电泳最关键就是得把样品处理好，现在最需要解决的先把样品中的盐尽量脱掉，至少高盐是肯定会影响你电泳的。关于超滤你可以这样理解，水和盐一起超滤，水更容易滤出，超滤过程中，总的盐是在不断减少，但相对溶液体积也在减少更厉害言实际是离子强度是越来越大了。所以当浓缩到一定程度补水再超滤，多次循环才能彻底把盐除去。具体重复几次只自己试了，这跟你补水的体积和次数都有关系。