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【求助】结晶条件无法重复出来，可能是？
【求助】结晶条件无法重复出来，可能是？
晶体照片在附件里，望高手能看看照片和我的描述给点建议或推测，谢谢。
最近在做一个蛋白的结晶，第一次用hamptonRearch的CrystalScreen I晒选条件时，在第15个条件（0.2M ammonium sulfate, 0.1M sodium cacodylate pH6.5, 30% PEG8000）中就长出了晶体（照片见附件），虽然比较小，但是很多。然而我自己配溶液长晶体就什么也没有了，用kit的溶液又重复了两次也重复不出来！蛋白都是同一批，只是长出来晶体那次是刚纯化出来的，而后两次的蛋白都是经过-70冻存的。难道冻存了就不行了？我想，即使是盐晶也应该能重复出来吧。
同时，CrystalScreen II的第35个条件（0.1M HEPES pH7.5,70% 2-methyl-2,4-pentanediol）也有晶体，并且在前后共三次用Kit的溶液都能重复出来——说明我的蛋白没有问题，或者说明这个条件三次长出的都是盐晶。
刚用hampton的染料染那些晶体，还不知道结果。如果染不上色就电泳了。
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最新回复
mamamiya (2014-4-12 10:18:42)
你重复的时候，条件原封不动吗?
mamamiya (2014-4-12 10:19:59)
yjf1026 (2014-4-12 10:20:19)
如果自己做的 溶液 结不出晶体，考虑可能是使用的试剂纯度与 kit 不一样，特别是 PEG 。
good luck!
qqq111 (2014-4-12 10:20:36)
1. 有的蛋白冻存后结晶能力下降。
2. 区别是否盐晶，在显微镜下看polarized状态。如果是蛋白结晶会是彩色的。而且盐晶通常很大。不知道您有没有量晶体直径。
个人意见，供参考。
hustwb (2014-4-12 10:21:00)
关于重复不出来的问题：截至目前为止，我用CrystalScreen-I-15的kit溶液重复了三次，只有第一次有晶体，就是图中左边显示的那些，后两次都没有晶体。我觉得第一次和后两次的区别就是第一次用的蛋白没有冻存国而后两次的冻存过。
关于是否是盐晶的问题：上面两个图里的晶体都很小，左图里的长度估计只有0.02mm吧（根据晶体和液滴的比例估算的）。用染料染了晶体，我看不清楚，明天请人去帮忙看看，然后过来讨论下。
谢谢各位！
mamamiya (2014-4-12 10:21:30)
很想知道你自配溶液是如何进行重复实验的。影响结晶的因素多，所以，详细谈谈，或许能有帮助，如浓度梯度等。曾经试窄范围重复，没有，变宽后，出来了。
上面有人说了，试剂的纯度很重要，特别是PEG。最近我用了不纯的PEG600，死活重复不出来，后来换了另外公司的产品，重复出来了。尽量用好试剂。
有点不明白，为什么不用能重复出来的第二个条件了?
hustwb (2014-4-12 10:21:55)
我用的试剂都是fluka的，水是18.2M欧姆的纯水，配试剂的管子都是新的corning管。ammonium sulfate 和 cacodylate sodium都配成1M的，PEG8000配成60%的，然后把三者按比例加在一起混匀做池液。ammonium sulfate 的浓度为25-200mM梯度，各梯度相差25mM； cacodylate sodium的浓度为50/100/150mM，PEG8000浓度为5%-30%，各梯度相差5%——组合在一起有144个条件。点晶体在20度操作，用96孔板做，先在孔里加1ul蛋白，然后加1ul池液。整个过程大概1h内完成，之后就放16度了。——还是不明白为什么重复不出来了。
我根据CS-II-35条件也配了溶液，进行了浓度梯度的筛选，发现晶体大小和数目没什么变化，都是又小又多又孪。
不过，在index的第42个条件也长出晶体了，自己配了溶液重复了一下，发现效果很不错，过几天上衍射看看。
am10 (2014-4-12 10:22:36)
晶体有偏光吗？
可以把液滴取出来，离心，去上清，把下面的部分加buffer煮，然后电泳。
晶体不能重复，你在第一次长的时候有没有温度的变化？也可以把第一次长的晶体试试seeding。
雁过留名111 (2014-5-06 22:54:56)
各位高手请指教一下 如何改善条件啊 包括蛋白样品的制备 结晶是采用的悬滴法 有时候吸取1ul的蛋白不能全部吸附到载玻片上 这样是不是对蛋白结晶影响很大
【求助】结晶条件无法重复出来，可能是？