【讨论】关于大分子量蛋白的活性电泳

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-12 10:45 作者: guagua 来源: 分析测试百科网

对于大分子量蛋白的活性电泳，欢迎大家提供试验经验！
我做的目的蛋白大约１２０kd，跑胶用的１０％的，感觉速度比较慢，６％又太软，８％左右速度比较好！
跑活性电泳电压不能太高，否则蛋白会受热变性．电泳时间不能太长，所以电泳液最好经常换新的，保证两个小时左右跑完！
但是我的试验也经常发生蛋白弥散的现象，一直没有找到合适的解决办法！
希望我的经验能起到抛砖引玉的作用，欢迎个位发表你们的经验！

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【讨论】关于大分子量蛋白的活性电泳

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abc816 (2014-4-12 10:46:20)

对于大分子量蛋白的活性电泳,我最近也在做,主要做LDH同工酶的分离,分子量为130KD-150KD.跑胶曾经用过10%,7.5%,现在主要用6.5%的分离胶,感觉每次都需要很长的时间,电泳液每次也用新的!在浓缩胶的时间大概需要1小时左右,分离胶的时间大概需要4小时左右!若是电流与电压都不大,时间还会更长!但是总是会存在蛋白弥散的现象!总是找不到比较好的实验方法!在此说说我的感受,请大家若有好的建议来发表发表!
guagua (2014-4-12 10:46:40)

一板胶下来跑五个小时，蛋白肯定弥散了？
你用的电压有多高？
你试试加大电压，在两个小时左右跑完。
guagua (2014-4-12 10:48:32)

电压100——200
guagua (2014-4-12 10:49:18)

对了，问问你，你的胶和电泳液配方是什么？
我这两天干脆跑不出来东西了！
abc816 (2014-4-12 10:53:08)

分离胶缓冲液配方:pH8.9 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到8.9定容到100ml。
浓缩胶缓冲液配方:pH6.7 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。
分离胶储备液：28g Acr，0.735g Bis，用双蒸水定容到100ml，过滤备用，4℃存放可以保存1个月。
浓缩胶储备液：10g Acr，2.5g Bis，用双蒸水定容到100ml，过滤备用，4℃可以保存1个月。
电泳缓冲液Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用时稀释10倍。
分离胶配方(T=6%)10ml(分离胶缓冲液1.25ml\分离胶储备液2.1ml\10%AP 50ul\TEMED 10ul\水 6.6ml
浓缩胶配方(T=3%)5ml(浓缩胶缓冲液0.625ml\浓缩胶储备液1.25ml\40%蔗糖 5ml\水 0.6ml\10%AP 25ul\TEMED 10ul
正如你说,我刚刚开始用电压为300V,会跑5h左右,每次跑出来的条带总是会有弥散现象,后来我加大电压为400V,跑2h,效果好多了!
flower-201 (2014-4-12 10:57:00)

我跑得是150KD的膜蛋白，用的分离胶是8%的，浓缩胶是5%的。我提取的是骨髓细胞的膜蛋白。
由于上次配电泳缓冲液，调PH的时候，把NAOH误拿成碳酸钠了，所以不知道是不是因为里面多了碳酸根离子的原因，最近跑电泳，速度好快啊，浓缩胶（不到一厘米）用七十多伏跑只用十五分钟，用110伏电压跑分离胶的速度也很快，第一次竟然五十五分钟搞定整个电泳。相同的电泳缓冲液第二次跑，又放慢了很多速度，也只用了一小时二十分钟就跑好了。
前面战友说蛋白弥散现象我不太理解是什么意思，但是我的条带在进入分离胶后会出现条带变宽的现象，倒是跑到下面的时候，粗粗的条带也能变细点，空白孔加的上样缓冲液这种现象就没有，不知道跟缓冲液有没有关系，或者跟电泳时放热太多有关系吗？
不知道有没有战友帮我解答一下我上面的困惑，谢谢！
2541 (2014-4-12 10:57:20)

你电泳速度也太快了吧！
对了，离子浓度大电泳速度也就是快，但是也会造成蛋白变性沉淀，你的电泳现象可能与此有关！
flower-201 (2014-4-12 10:57:44)

图片(1)是我的目的蛋白电泳图谱!请大家鉴定一下!

36166459.jpg
flower-201 (2014-4-12 10:58:29)

图片(2)是我今天跑的电泳图谱!

10107885.snap.jpg
flower-201 (2014-4-12 10:58:47)

各位研究大分子蛋白活性电泳的同仁们,我发现了能够跑出条带的新型PAGE电泳,即连续性PAGE电泳系统,不用制备浓缩胶,只用分离胶!不信,大家可以试试!