【求助】做过糖蛋白亲和的进来下吧

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-12 11:06 作者: applebook=213 来源: 分析测试百科网

查看完整版本请点击这里：
【求助】做过糖蛋白亲和的进来下吧

是指这种缓冲液中含有 10 mM sodiumphosphate, 150 mM sodium chloride, 1 mM MnCl,, and 1 mM CaC12,并且PH为7.0.

查看完整版本请点击这里：
【求助】做过糖蛋白亲和的进来下吧

我也来说两句查看全部回复

最新回复

ending (2014-4-12 11:07:16)

翻译：
从步骤3收集的每个部分无须进一步处理，直接上刀豆素亲和柱，柱子预先用由10 mM 磷酸三钠，150mM的NaCl，1mM的MnCl和1mM的CaC12组成的缓冲液（PH7.0）平衡。蛋白溶液上样后，洗脱速度在12 cm/h的线性流速。在洗脱之前用的是与平衡缓冲液相同的缓冲液进行淋洗，直到从吸光度上估计蛋白含量小于0.1mg/ml。
以上是个人理解供参考，另外最好提供全文，有些东西需要上下文才可以很好的理解。
关于a buffer containing 10 mM sodium phosphate
我认为其组成即是10 mM sodiumphosphate, 150 mM sodium chloride, 1 mM MnCl,, and 1 mM CaC12,调PH至7.0，因为磷酸钠本身就有三级解离，形成磷酸钠缓冲液所需的酸碱对。
个人理解供参考。
applebook=213 (2014-4-12 11:07:48)

根据下面文献里的这句话
Each fraction from step 3 was applied without
further treatment to a column of Con Aagarose
equilibrated with a buffer containing 10 mM sodium
phosphate, 150 mM sodium chloride, 1 mM MnCl,, and 1 mM
CaC12, pH 7.0. The protein solution was applied and eluted
at a flow rate of 12 cm/h. The column was washed with the
same buffer until the protein concentration dropped below 0.1
mg/mL.
有个问题就是，a buffer containing 10 mM sodium phosphate 是指10 mM磷酸钠缓冲液还是10 mM的Na3PO4 ？
applebook=213 (2014-4-12 11:08:06)

翻译：
从步骤3收集的每个部分无须进一步处理，直接上刀豆素亲和柱，柱子预先用由10 mM 磷酸三钠，150mM的NaCl，1mM的MnCl和1mM的CaC12组成的缓冲液（PH7.0）平衡。蛋白溶液上样后，洗脱速度在12 cm/h的线性流速。在洗脱之前用的是与平衡缓冲液相同的缓冲液进行淋洗，直到从吸光度上估计蛋白含量小于0.1mg/ml。
以上是个人理解供参考，另外最好提供全文，有些东西需要上下文才可以很好的理解。
关于a buffer containing 10 mM sodium phosphate
我认为其组成即是10 mM sodiumphosphate, 150 mM sodium chloride, 1 mM MnCl,, and 1 mM CaC12,调PH至7.0，因为磷酸钠本身就有三级解离，形成磷酸钠缓冲液所需的酸碱对。
个人理解供参考。
......

==============================================================================================================

我昨天、今天配制了3回0.01M 的磷酸钠buffer，然后分别溶解NaCl，MnCl2。但每次加入CaC12时候，出现絮状沉淀。为什么？哪里做得不对？
我问过一个学化学的，解释说：中性溶液肯定会磷酸钙沉淀。我该怎么办？
ps:我另重做了遍，把NaCl，MnCl2，CaC12先分别用超纯水溶解成溶液，再逐个加入到0.01M 的磷酸钠buffer。当加入CaC12溶液时，同样出现沉淀？何故？
急
谢谢
PINK (2014-4-12 11:08:30)

看看CaC12的纯度如何，我配１M的CaC12时经验是，必须加热才可溶解的快，完全溶解也需几十分钟，并且之后还须过滤，滤纸上面会有黄色杂质，根据产品不同，杂质量差别很大，我以前在外面一个店里面买的，杂质特别多．和科里面订的不能比．我们用的为广州汕头市，西陇化工厂的．
另外从百度上搜了一个资料：
在20℃时，氯化钙的溶解度是37700mg/L；在0℃时，重碳酸钙的溶解度是2630mg/L；而碳酸钙溶解度只有20mg/L，磷酸钙的溶解度就更小，是0.1mg/L。此外，碳酸钙和磷酸钙的溶解度与一般的盐类不同。它们不是随着温度的升高而升高，而是随着温度的升高而降低，
cuturl('http://www.jiaxuezhong.cn/jiaxuezh5/gzjxz591/')
对于磷酸钙其本身就很难溶，从上面看应该是在低温下溶解．另外看来这样的话层析最好也在低温（不过对于蛋白的层析也应该低温）．还有我认为也没有必要这么死板，先在低温下溶解，然后放室温，如果有沉淀过滤掉（如果没沉淀当然最好了），如果这个方式溶解的情况下可以洗脱下来就行了．
当然每个试剂都应该精确称好．
redbutterfly (2014-4-12 11:08:47)

here is Na2HPO4-NaH2PO4 BUFFER，you can use the NaAC-AC buffer.
applebook=213 (2014-4-12 11:09:16)

here is Na2HPO4-NaH2PO4 BUFFER，you can use the NaAC-AC buffer.

=====================

thanks
i am thinking about it
applebook=213 (2014-4-12 11:11:18)

here is Na2HPO4-NaH2PO4 BUFFER，you can use the NaAC-AC buffer.

============================

er～
can NaAC-AC buffer be pH7.0 ？
applebook=213 (2014-4-12 11:12:10)

the pH of NaAC is >7,so by adding HAC,it will be 7.0.

===========================

but i need 10mM NaAC-HAC
can u give some idea？
applebook=213 (2014-4-12 11:12:31)

NaAC is 10mM, HAc is just to adjust the pH.
H2O (2014-4-12 11:13:33)

sorry, dont use NaAC buffer, but use the hepes buffer (pH7.0-7.5). it is very fit for.
qianqin1977 (2014-4-12 11:13:51)

mM中的M本身就是mol/L的意思，所以肯定是指的缓冲液了。并且pH为7.0才对。你要是只加磷酸钠pH肯定不是7.0，最好配制的时候就用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠按一定比例混合配制。
H2O (2014-4-12 11:14:10)

糖蛋白亲和层析，磷酸缓冲液有其缺点，建议用hepes或Tris缓冲液。由于与蛋白质结合的糖链结合阳离子，不新鲜的磷酸缓冲液可能有影响。具体原因与纯化的糖蛋白有关。
applebook=213 (2014-4-12 11:15:03)

糖蛋白亲和层析，磷酸缓冲液有其缺点，建议用hepes或Tris缓冲液。由于与蛋白质结合的糖链结合阳离子，不新鲜的磷酸缓冲液可能有影响。具体原因与纯化的糖蛋白有关。

================================================================================

谢谢
我几天配了N次磷酸缓冲液了，一加氯化钙就出现絮状沉淀呀。真怀疑，按文献上他们是怎么做出来的？？
我今天用了tris buffer，貌似pH好难调为7呀。改天试试hepes buffer了。
ps：今天亲和层析，发现大部分在平衡时被冲洗掉了，wash得到的及其微量呐！我哭～
能告诉我你的经验不？
H2O (2014-4-12 11:15:23)

Your protocol had problem.
I have ever purified a-glucosidase.
1. To Con A agarose affinity chromatography, the sugar in your protein binds to ConA, so you must use the buffer containing Methyl-a-glucose or Methyl-a-Mannose to
wash( for a-glucosidase).
2. The glycoprotein is easy to be solubilzed by high concentration of salt, thus you had better equilibrate the column with a buffer containing 40 mM hepes pH7.0, and
protease inhibitor, then use the same buffer containing 15 mM Methyl-a-Mannose to
wash.
applebook=213 (2014-4-12 11:15:49)

QUOTE:
原帖由 H2O 于 2014-4-12 11:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

Your protocol had problem.
I have ever purified a-glucosidase.
1. To Con A agarose affinity chromatography, the sugar in your protein binds to ConA, so you must use the buffer containing Methyl-a-glu ...
40 mM hepes pH7.0 ？so much！（why not 10mM as same as the paper above？）
and 15 mM Methyl-a-Mannose ， so little！（why not 150mM as same as the paper above）
applebook=213 (2014-4-12 11:16:38)

oo
is it need that the hepes buffer contain 150mM NACL, 1mM CACL2 and 1mM MNCL2 ?
applebook=213 (2014-4-12 11:17:19)

By the way, can u give me some paper about this purifier with this hepes buffer?

ps:For more info , ur phone is ?
H2O (2014-4-12 11:17:38)

is it need that the hepes buffer contain 150mM NACL, 1mM CACL2 and 1mM MNCL2 ?
unnecessary. please try. Na+, Ca2+, Mn2+ can bind glycoprotein, so you prepare the buffer containing 2mM DTT or other protease inhibitor.
applebook=213 (2014-4-12 11:18:25)

i please try. Na+, Ca2+, Mn2+ can bind glycoprotein, so you prepare the buffer containing 2mM DTT or other protease inhibitor.

==========================================================================================

i tried。i got the gragp below from Akta purifier 100.
there are some problom。
1、洗脱出目的蛋白的过程太长，有人说是“15 mM Methyl-a-Mannose”浓度太低，起不了作用。你怎么看？
2.我收集的如图的洗脱峰溶液进行冻干，发现粉末里hepes也在里面，而且占大量，这不相当于又引进了杂蛋白了吗？
3.文献用离心过滤膜，但考虑到我亲和得到的收集液量比较大，很费离心过滤膜。不知道我选冻干此法合适不？
谢谢

51510973.jpg
fsdd817 (2014-4-12 11:18:44)

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=9920277&sty=1')