【求助】ｗｅｓｔｅｒｎ为什么刚开始荧光很强...

最新回复

• yes4 (2014-4-12 15:06:18)

  
  可能体系中有太多的HRP很快消耗掉底物，而致信号很快消失，可以稀释二抗，再增加ECL用量试试

• am10 (2014-4-12 15:07:06)

  你好，红灯你可以购买专业的暗室红灯（一个大盒子，上面有几种颜色可切换的灯），（照相器材店可以买到，部分试剂商也可以定购）。
  至于荧光很快看不到，很可能是因为你二抗的浓度过高，需要成倍稀释你的二抗（最好能把你的实验条件写出来，便于大家给你想办法），另外，质量差的保鲜膜、过于灵敏的显色底物都可能造成淬灭
  祝实验顺利

• xevin (2014-4-12 15:07:26)

  我做的是大鼠子宫ERa，一抗用的是santa的抗体，1：200倍稀释，室温孵育2小时，洗膜4次，每次20分钟，二抗也是santa的抗体，1：7000稀释，室温孵育1个半小时，洗膜4次，每次20分钟，然后就是加ECL，大概600ul，以前我做过好几次，没有出现荧光卒灭的现象，就昨天的失败了。还有我的条带除了有目的条带外，还有些杂带，怎么解决？是否与我的抗体浓度有关呢？

• nut6694 (2014-4-12 15:09:33)

  
  有杂带，你的一抗和二抗的浓度都有些偏高，我们一般一抗1：1000左右即可，二抗1：10000左右。加完ＥＣＬ后能看到清楚的绿色荧光，说明你的膜上HRP量很大。

• 89tongzijun (2014-4-12 15:10:44)

  气温以及湿度的变化，都会造成WESTERN BLOT结果的改变，温度高，造成HRP催化的效率高，这个时候就容易出现淬灭，这就能解释相同的条件，以前同等的条件，现在做出的结果就不成功。
  所以我们就要对抗体浓度做出相应的调整，你做好能把二抗做个梯度，然后，孵育时间缩短到一小时，祝实验顺利

• yjf1026 (2014-4-12 15:10:59)

  有杂带，还要考虑封闭是否充分及正确，我们一般是5％脱脂奶粉室温1－2小时！磷酸化的抗体除外

• xevin (2014-4-12 15:11:23)

  是否一抗4度过夜效果更好，而室温孵育效果差些，容易有杂带呢

• birdfish (2014-4-12 15:12:22)

  
  请问你，1：7000的二抗应该怎么配啊？是1ul加入7ml还是0.1ul加入700ul呢？
  如果是前者的话，那我一次如果用不了这么多，剩下的怎么保存呢？能够保存多久呢？如果是后者，0.1ul话能够吸的准么？
  非常感谢

• xue258 (2014-4-12 15:12:57)

  是否一抗4度过夜效果更好，而室温孵育效果差些，容易有杂带呢
  
  =============================================================================================================
  
  一抗四度摇床过夜效果要更好，但是不是说杂带就会少些，是说抗体与目的蛋白的结合更好，而杂带，则与封闭，洗膜，以及抗体特异性关系大一点
  另外，回楼上战友：
  一般都是1ul加入7ml.如过是700ul总量的话，二抗很难与一抗充分接触，为了省一点并不昂贵的二抗，前功尽弃的话，是不是有点得不偿失啊。
  此外，可以用保鲜膜封上在四度保存，大概可以重复用到牛奶臭为止（3天），当然，如果加入防腐剂就可以保存更长时间了（不用叠氮钠就成），但是，不是很赞成二抗长期使用，没必要，呵呵
  祝实验顺利

• jujuba (2014-4-12 15:13:17)

  
  用多少配多少吧，我觉得如果你用5ml那就加 5000/7000 ul 二抗好啦

• 131415 (2014-4-12 15:13:37)

  
  请问要检测磷酸化的抗体如磷酸化P53,AKT,哪几个过程需要特别注意，谢谢。

• 131415 (2014-4-12 15:14:02)

  
  请问要检测磷酸化的抗体如磷酸化P53,AKT,哪几个过程需要特别注意，谢谢。
  还有我买的是Cell signal公司的一抗和二抗，它的说明书上推荐一抗1：1000，二抗1：2000，我按照这个方法做的结果有的蛋白结果较好，有的蛋白始终有杂带。还有就是磷酸化抗体总是做不好，请指教，谢谢。