【求助】我的western 图杂带很多啊，惨不忍睹？

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-12 15:15 作者: 89tongzijun 来源: 分析测试百科网

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【求助】我的western 图杂带很多啊，惨不忍睹？

大家好，我是western新手，做的是p－p38，是从组织中提的蛋白，一抗用的是CST的，做了很多次，目的条带很弱，还有很多杂带，曝光时荧光淬灭的很快（二抗，曝光底物其他的western用的都很好），请大家多多指教，谢谢大家！！！

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qqq111 (2014-4-12 15:15:43)

磷酸化蛋白表达量一般比较少是比较难做的。
如果杂带比较多，你可以考虑改进一下封闭时间。不过最好将你的图传上来大家看看，不知道杂带是怎么个多法？
荧光淬灭快。用普通的ECL做荧光淬灭是比较快的。不知道你说的其它western做得好是指哪些蛋白。不要去和容易做的蛋白去比，容易做的蛋白由于一抗比较好，背景低，荧光是不容易淬灭的。一般只要你的荧光第一次可以用3分钟曝出来，再过3分钟，还可以再曝光一次，也就不算弱了。
呵呵！
panda王 (2014-4-12 15:15:59)

您要是能把试验图以及试验方案放上来,我想能更好帮助您解决问题.
xyw5 (2014-4-12 15:16:17)

图上看，你的膜没有洗干净，上面粘有含有二抗的液体，所以导致图为黑色。建议洗多一次膜。另外压片时将膜滤干。就可能不会出现上图问题！：）
89tongzijun (2014-4-12 15:17:27)

一抗是cst的，1：1000稀释，二抗（1：10000），曝光底物都是实验室常用的。3%BSA封闭一小时，一抗4度过夜，二抗室温摇一小时。曝光时荧光不到一分钟就淬灭，太让人伤心了，呜呜呜。
图中间很弱的条带是目的条带。

61393202.jpg
ii077345 (2014-4-12 15:17:48)

可以考虑封闭过夜吗？
lxh031 (2014-4-12 15:18:05)

可以封闭过夜，而且效果还不错
moonlight45 (2014-4-12 15:18:23)

我刚刚开始做wb,很奇怪的是我的条带很清晰，而在目的条带的旁边还有一条亮度差不多的条带，让同学用我的抗体做之后就是一条带，我再做又是两条带
tuuu2 (2014-4-12 15:18:40)

建议一抗使用5%脱脂奶粉配制，这样背景会低很多