【求助】蛋白表达太低

最新回复

• 逗号是句号 (2014-4-12 15:32:06)

  
  你说的太简单了把，好多参数不知道，怎么确定什么原因呢？
  比如是不是超声时间太长？电压太高？
  你把那些蛋白跑的电泳？上清？沉淀？还是都有？
  全细胞的话？产量如何？是不是都成包涵体了啊？
  还有什么缓冲液？。。。。。。。。。。

• gogo (2014-4-12 15:32:22)

  
  从你的描述中你的蛋白不是很稳定;
  你大量获得,要优化好多条件,关键是量的问题,你优化下表达条件,这是重点!

• pengke1983 (2014-4-12 15:34:12)

  
  哦，不好意思,这个版面是我用别人帐号发的.现在我把我做的方面描述一次
  我将这个菌株在LB上摇到OD=0.5左右,然后加IPTG,摇床100转,诱导4小时.收菌时制样跑胶,发现蛋白有表达,但是量不大(见附图,重组基因大概200个氨基酸,再加上GST标签之后就是大概48KD左右),在电泳图上可以看到在20多KD的位置有一道比较明显蛋白,估计是GST来的.我收菌,反复冻融3次后超声,25%功率超4S停9S,每5分钟制样一次,分别制全菌,上清和沉淀样,跑胶后发现在上清是有小部分蛋白表达,但是相对的沉淀更多,5、10、15分钟的样在沉淀上有很多杂蛋白，我就估计是超声不完全，但是在20分钟的样上沉淀，上清和全菌的样的蛋白的量就很少了，无论是目的蛋白和杂蛋白都没有了，我现在将这个基因转到PET-32a载体上试试了，还在做，请各位高手帮我解决解决~~

• 逗号是句号 (2014-4-12 15:34:31)

  
  确实不是太高，pET系列应该好些，表达会高一些，不过形成包涵体也不是很希望的啊。
  你用什么质粒啊，启动子强吗？
  你是大肠杆菌吧？为什么冻融后再做sonication呢？直接超声如何？还有，你的蛋白目的是做什么，酶？抗原？还是别的？
  IPTG浓度多少呢？诱导温度？
  交流很好！！！呵呵

• pengke1983 (2014-4-12 15:35:19)

  
  我用的质粒是PGEX-4T-1
  连接后转化到大肠杆菌DH5α进行PCR鉴定基因序列是正确的,在DH5α上进行过一次小量诱导,但是不表达.接着我就提质粒转BL21诱导,表达量如上图所示,左边一道是Maker,中间一道是BL21的空菌.冻融是为了超声效果更好,还没试过直接超声,但是在我5分钟的超声结果应该可以看出细胞破碎得还不是很理想,我现在找找那张电泳图传上来给你看看吧.我蛋白是用来做抗原的,量太少就不能进行免疫了~~谢谢交流

• pengke1983 (2014-4-12 15:35:44)

  
  IPTG浓度是0.5M,诱导温度30度,摇床100转

• damingxia0904 (2014-4-12 15:36:01)

  蛋白不稳定啊,优化表达条件啊,降低温度到20度,IPTG为1mM;转速为180rpm

• pengke1983 (2014-4-12 15:36:22)

  
  不好意思,我上面说错了,我上面说的0.5M是1000×的,其实工作浓度是0.5mM.但是我曾经试过16度,150rpm诱导了,结果还是这样

• niangao1980 (2014-4-12 15:36:43)

  
  从电泳图上看，应该是你的蛋白在表达的过程中就被大肠杆菌的蛋白酶降解了，而且断裂的位置不止一处。这说明你的蛋白不适合与GST进行融合可溶性表达。一般情况下很少出现蛋白在表达的过程中就降解的情况，而且楼主后面的超声处理会加速蛋白的断裂，这种方法到最后很难得到你的蛋白。
  楼主是用来做抗原进行免疫的，对于该蛋白的活性要求不高，建议楼主不要进行GST融合表达（GST融合表达极易出现断裂），而且如果自身就容易断裂的话，最好进行包涵体表达，加上HIS tag，在后面处理的时候尽量低温，加上些蛋白酶抑制剂，应该不难纯化的。

• 逗号是句号 (2014-4-12 15:37:02)

  
  IPTG浓度太高了吧，0.5M？转速250-300rpm，保证溶氧。如果包涵体也可以用作抗原的话，温度问题不大。这么高的IPTG浓度没试过会出现什么效果。我们一般用0.1，0.2，0.4，或者1mM。是你的1/500-1/5000。
  超声5分钟还好，你可以在普通显微镜下看看E.coli的破碎情况，很容易能看到它的破壁效果。
  ps：我们做诱导做的IPTG母液浓度是0.5M。

• pengke1983 (2014-4-12 15:37:19)

  谢谢,我现在就准备转到PET-32a上表达试试了,结果怎么样我会再跟大家讨论,谢谢大家的帮助