【求助】WB还能做成这个样子!怎么解释?

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• 11_hjx (2014-4-13 00:30:49)

  
  检测TIMP-1
  WB:电泳：70伏1小时，100伏1小时 分离胶12% 浓缩胶5%
  转膜: 15v,35分
  仪器是BIO-RAD公司的半干转移

  
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• 11_hjx (2014-4-13 00:31:08)

  
  封闭：PBST20ML+1克脱脂奶粉（5%）室温下3小时，在摇床上轻摇
  洗膜：PBST 洗膜10分钟*3次现在 都洗四次
  一抗孵育; 4度过夜， 大于12个小时
  一抗稀释33μL+一抗稀释液5mL（碧云天）1：133 稀释

  
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• 11_hjx (2014-4-13 00:31:27)

  洗膜：PBST 洗膜10分钟*3次现在都洗四次
  二抗孵育;碧云天HRP二抗7μL+5%脱脂奶粉PBST20ML室温下1小时，在摇床上轻摇
  洗膜：PBST 洗膜10分钟*4次

  
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• zzzz (2014-4-13 00:33:34)

  这团东西是什么啊
  对一下Marker看看 有没有你的目的蛋白
  如果没有 就是一抗没抗上去
  如果有 背景太深

• moonlight (2014-4-13 00:33:59)

  好奇怪的东西，是不是转膜的问题。把你转膜后的胶染色脱色看看

• 莲花白 (2014-4-13 00:34:17)

  完全没有条带？
  胶没凝好，可能是
  建议快绿或者丽春红染膜，如果没有清晰的蛋白条带的话，可以不进行后续的一抗二抗步骤

• summerxx (2014-4-13 00:34:37)

  一 （ 1）用MARKER对照的话，如果这个在目的蛋白的分子量位置，就需要优化实验条件了 ，首先个人认为你的一抗二抗浓度太大，并不是封闭的问题
  (2) 建议跑完胶用一部分胶做一个考染，然后转膜完做一个立春红染色，因为可能存在你的样品跑出的条带不成型，逐步推断观察是哪一步出了问题，如果染色观察条带都很清晰干净，则调整一抗二抗浓度以及孵育时间即可。
  二 如果证明此条浓带不是你的目的蛋白，那就需要加强封闭，同时要更改一抗二抗比例，当然也有可能是一抗特异性问题，总之，一步一步分析即可，希望对你有帮助，
  祝实验顺利
  

• 131415 (2014-4-13 00:34:56)

  
  1。要加marker, 否则怎么知道是不是你的目的条带位置。
  2。我觉得转膜这一步可能没有问题。
  3。1抗明显浓度太大。
  4。做梯度试验，蛋白上样量，1抗，2抗。 摸条件。
  还是比较乐观的，楼主不要灰心，只需要改变试验条件，应该能出来。

• summerxx (2014-4-13 00:35:16)

  
  你用的是化学发光法暴光的胶片吧，我曾做出过和你差不多的胶片，换成用平常的显色方法显色反而很好，主要是化学发光法太灵敏了，条带太浓太粗挤成一团，减少胶片暴光时间，甚至几秒钟就可以，会使条带变窄变清晰，再不行就减少一抗浓度。如果你可以确认那些一团团的就是你的蛋白印迹带，上述方法不妨一试。