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【求助】检测磷酸化蛋白 底片无显影，原因待查.,.
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我检测的是p-akt ,分子量66kd,蛋白抽提时我已经加上了磷酸酶抑制剂，溶解样品时也加了磷酸酶抑制剂。
电泳 转膜都没问题，（转膜后用丽春红染5分钟，可以看到蛋白条带，marker也转的很好，）用蒸馏水冲洗了两次将多于的丽春红冲洗掉，继续下一步操作。。根据蛋白大小和maker的位置将目的蛋白和内参分别剪下， 封闭用5%脱脂奶粉TTBS 1小时，抗体稀释液TTBS，一抗(1：1000多抗)1小时，tbst 3*10min ,二抗(1:5000)1小时，tbst 3*10min 均在室温.一抗 二抗都是cell sognal ,新买的。ecl发光液是北京普利莱的，刚买了不到半年，，显影定影液是别人配置的，配置后室温放存一个月，，压片三分钟，（肉眼没看到荧光）结果两个蛋白都没有显影，底片一片黑色。。将底片放到显影液里不到十秒钟就便的乌黑。
各个步骤应该没问题吧，
不知道什么原因，请各位高人指点。
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最新回复
mogu (2014-4-13 01:41:25)
1.做磷酸化的WB最好用3%BSA封闭。
2.一抗孵育的时间似乎有点短，我一般是4度过夜孵育。
小游abc (2014-4-13 01:41:53)
呵呵，检查一下你的显影液，胶片和暗室密封的程度，其中 必有问题，等检查完这些硬件，能压出干净片子的时候，再继续从技术层面考虑这个蛋白怎么做
凭个人的经验，片子丢到显影液里变的乌黑，
可能性最大的是显影液不匹配，第二个可能是片子曝光了，主要是这两个问题，排除以后。若还未解决，可考虑暗室问题
jiushikeshui371 (2014-4-13 01:42:19)
我记得当时我同时剪下了两块底片，一块压片；另一块 在红灯地下找了以下（验证是不是在红灯下能使底片曝光）接着就放在了显影液里，接着这块底片也马上便黑了。。难道是整合底片都曝光了？？？
另外，我想把膜重新处理，在加一抗，二抗，压片曝光，可行吗，，该如何操作。。即使目的蛋白不显影，总不能内参也不显影啊 。。第一次做wb ，啥都是现学的，，还有好多事情要做，，急死人啊 。。
jiushikeshui371 (2014-4-13 01:42:50)
QUOTE:
显影液不匹配？、难道显影液还分型号？我们用的是普利莱的ecl超敏发光液啊小游abc (2014-4-13 01:43:08)
是这样的，我曾经买了一种大袋装的显影液，结果片子一丢进去，就变的乌黑，呵呵
小游abc (2014-4-13 01:44:24)
QUOTE:
红灯底下是不会曝光的，除非你的红灯露光，这种情况也是可能的奥。。。。你可以直接剪底片放在显影液里，然后从别的单位能正常做WB的显影液要一点来，做个对比，哪个环节出了问题就很明确了
建议你先把这个问题搞清了，再进行你的实验
膜经过处理是可以重加一抗二抗的，这个你放心，
实验要一步来，要有耐心，把思路理清，按顺序解决问题是关键
祝实验顺利奥
jiushikeshui371 (2014-4-13 01:44:43)
今天我又发现了一怪事。。
我想把膜用洗脱液洗洗，重新加一抗，二抗，再显一次影试试。。。于是从院子里找了一个配方，stripping buffer0.5M NaCl，0.5M HAc，室温摇床15min。
然后用tbst洗3*5分钟。。又用丽春红染了5分钟，居然发现膜上啥都没有(转膜后我用丽春红染了一次，条带很清晰，很好的)。难道是我把膜上的蛋白戏没有了，导致显影是底片一片黑色？？
怪怪的，也不应该是stripping buffer的问题。。昨晚，我显完影后就用保鲜膜把膜包好放在也4度，应该也不会有问题啊。
jiushikeshui371 (2014-4-13 01:45:25)
小游abc (2014-4-13 01:46:12)
呵呵，没用过你这种BUFFER，所以不敢妄加评论，
想问个问题，你的膜显影过后，有没有把ECL洗去呢，如果没洗的话，就保存，可能会有不好的影响，、
到底是哪个地方处了问题，你可以尝试重新转张膜，染色（这时观察有条带），然后洗干净，STRIPPING,再染色，如果没有了，不就说明问题一定出在BUFFER上了么，你说可对，
祝实验顺利
jiushikeshui371 (2014-4-13 01:46:44)
丽春红没有染上 ，是不是就是没有蛋白了呢。我用的这个配方不会把蛋白和抗体一块洗去了吧。。
另外，如何把ecl洗去呢，是不是还是用tbst 洗三次每次十分钟啊？、
小游abc (2014-4-13 01:48:17)
哈哈，应该作的
强烈建议你换个配方吧，活着买现成的，呵呵，也不贵
ECL用清水多淘几遍就OK了，双蒸水五分钟三次就没问题了
祝顺利
windy+++ (2014-4-13 01:48:40)
ECL液带着也没什么大事儿（很不负责任的说…… -_-!），有时懒得弄就让它那么干了，过几天再strip，杂Actin也能出，效果不很好就是了
strip完TBST洗后该不影响丽春红染色，没了可能就是蛋白没了……因为没用过那个srtip液，所以不好说，要不就再用快绿染个？要是都不出就是没有了……对了，还可以直接让膜半干，有蛋白的话蛋白条带半透明，而没蛋白的部分是白色的，应该比叫直观，要是这几种方法都不行那就是没蛋白了……
很多strip的配方和条件感觉都比较苛刻，比如我们用的（β－巯基乙醇 800ul，SDS 2g，tris 0.765g，去离子水定容至100ml，PH调至6.7)推荐是70度1h，可是我们60度15min就感觉预染Marker变淡了，不知道是不是反复使用的缘故，说到这儿想起来，要是你的蛋白有跑预染Marker的话，看Marker就知道是不是被Strip没了
显色液貌似有快显 慢显两种，我们自己配的快显太快了，后来干脆稀释上2－4倍使用，控制显影时间在15－30s，当然用一段时间后显影时间会有延长，后来组里买了台洗片机，就只能控制曝光时间了……
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