【求助】请问跑SDS-PAGE时，loading buffer什么时间加入好？

最新回复

• 66小飞侠 (2014-4-13 20:26:11)

  
  1.loading buffer应该在加样前与蛋白等体积混匀,然后煮样5分钟,先单独加热变性蛋白样品后再加入loading buffer上样是错误的操作方法
  2. 5%的浓缩胶和12%的分离胶在室温下十几分钟到半小时内凝固都是正常的,冬天半小时后凝固也是正常的

• 嗅嗅 (2014-4-13 20:26:38)

  
  请教，loading buffer与蛋白等体积混匀吗？好像是按蛋白与SDS的比值来加的吧。

• BUK (2014-4-13 20:27:00)

  
  不一定是等体积混合，他说的那种是预先配制的2× buffer，这种就是一份样品加一份buffer，有1×，4×等多种配制浓度，不同浓度添加比例都不一致，最终使你的混合液变成1×就对了。
  buffer、样品溶液是混合后再加热的，这是使SDS和蛋白质充分结合形成复合物的一个过程，且SDS相对蛋白质必需过量添加，结合不充分会对后面结果造成干扰。

• 嗅嗅 (2014-4-13 20:29:07)

  
  楼上的解释很合理哈，那如果样品浓度很低，而梳孔的上样量有限，可不可以不稀释成1×的呢，以保证SDS过量？

• BUK (2014-4-13 20:29:25)

  
  1×一般用于直接添加干粉样品，为了保证电泳的检测灵敏度想增加样品上样量，那可以选择4×的（同样上样量可以加3份样品，1份buffer，那么样品上样量就提高了）。但如果样品浓度过低也就没意义了，杂蛋白都不能检出（药典上对上样量是有要求的）浓度不足的话，得想办法把样品浓缩再检测。可控制蛋白浓度以保证SDS过量，SDS一般是高于蛋白质量的3～4倍就可以了。

• dongdongqiang (2014-4-13 20:29:44)

  等体积好像不是很好把，我一般是1：4，不过我的1× buffer的

• 喵咪 (2014-4-13 20:30:12)

  最好估计蛋白质的ug数，以便个上样孔蛋白质等量。1XBUFFER 对各孔一样等体积加入， 再煮沸2-3分钟，冷却3分钟，加人样品孔。
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  等体积好像不是很好把，我一般是1：4，不过我的1× buffer的

• 蒲公英 (2014-4-13 20:30:36)

  
  蛋白浓度低要用高浓度的buffer，比如5X的
  样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止煮干或挂壁损失

• 喵咪 (2014-4-13 20:30:57)

  QUOTE:

  原帖由 蒲公英 于 2014-4-13 20:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  蛋白浓度低要用高浓度的buffer，比如5X的
  样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止煮干或挂壁损失

  样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止煮干或挂壁损失

• 喵咪 (2014-4-13 20:31:20)

  样品加入eppendorf 管，盖好并用特制的盖夹固定，煮1-3分钟，不用担心煮干或挂壁损失，由于1XBUFF 含有蔗糖等物质。
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  样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止

• 算盘阿星 (2014-4-13 20:31:41)

  
  煮沸之前加loading buffer, 我们用4×的，加的量是样品量的1/3，涡旋混匀，然后封口胶封好，放入固定板中，沸水中煮3min就可以了。封口胶封住后不用担心水蒸气进去。之前说的固定板，其实很简单，就用泡沫塑料什么的弄几个洞，把EP管插进去就行了。另外，一个很简单的思路，关于loading buffer先加还是后加的问题，如果后加，buffer还有什么用呢，蛋白加热煮沸，不就和煮鸡蛋一样了吗，呵呵，这是我原来犯过的错误Smile
  12%的分离胶，因气温的不同凝胶时间不同，有一个简单的方法，正丁纯封胶后，如果分离胶凝固好了，会在胶与正丁纯间有一明显的介面。
  5％浓缩胶，比分离胶时间要快，可以根据剩下的浓缩胶来看，观查烧杯中浓缩胶是否凝固，以判断，就是说如果烧杯中的浓缩胶凝固好了，那么制胶也就可以了。