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【求助】原核表达问题

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-13 21:48    作者: nikun230    来源: 分析测试百科网

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【求助】原核表达问题
各位同仁：我的基因来自于植物，载体是pet28a，双酶切鉴定构建正确，IPTG诱导４，６，８小时，浓度也设梯度了（０.1,0.4,1mM）可是不见目的条带啊(通过marker),请各位指教。另外我的基因没有去掉信号肽，是于这个有关么？
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最新回复

  • redbutterfly (2014-4-13 21:48:53)

    可能是菌的问题吧．　　
    多接几个菌，诱导后同时跑胶，比较一下表达情况．

  • nikun230 (2014-4-13 21:49:33)


    我已经做过几次了，都是没有见到表达啊！Sad

  • nikun230 (2014-4-13 21:49:50)


    我做过几次了，结果都是一样的。不见表达

  • 梦幻苹果 (2014-4-13 21:50:08)


    主要是看酶切位点选择的时候有没有移码现象。如果没有可能就是菌株的问题了。

  • wood533 (2014-4-13 21:50:29)


    我觉得应该把信号肽去掉，我的蛋白就是这样才能表达

  • luoliqiong (2014-4-13 21:50:51)


    这和菌株有很大关系吗？ 不太知道 但是很多蛋白，特别是真核生物蛋白在大肠杆菌表达，有很多蛋白质必须去掉信号肽才行

  • 12xunmei (2014-4-13 21:51:14)


    建议从以下几方面考虑：
    1、是否已去掉内含子序列？原核生物中是没有内含子剪接功能的，但植物大多数编码基因都是有内含子序列的，获得无内含子的植物基因可利用RT-PCR方法。
    2、密码子偏好性问题。同一个氨基酸，植物的密码子使用和原核生物中大相径庭，这也是多数真核基因中原核中难以表达或难以高效表达的原因所在。建议先分析一下你的目的基因是否含较多的原核生物稀有密码子。原核生物稀有密码子主要有：AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和 CGG。
    3、查看一下你的插入基因和前后的融合肽段是否对框，以及中间是否有出现终止密码子的碱基突变。但相信你不应该犯如此低级的错误。

  • linlinstar (2014-4-13 21:51:46)


    我也遇到这个问题，换了一个载体还是不行，我想问问楼上信号肽怎么去掉呀！！！急呀
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