【求助】胶跑成这样子有谁见过?

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-14 16:07 作者: PCR 来源: 分析测试百科网

又来麻烦大家了。呵呵。
本来马上要转膜了，可忽然跑胶出了问题，一次不如一次，以致于没有把握转了。郁闷的是我的操作没有任何改变，以前就只是跑道的底色脱得不漂亮这一个问题，现如今——最典型的就是图片上这样的情况，请大虾们指点。提前谢了。
注：15%的分离胶，我的目的蛋白是26KD。前两道是我的，左数第三道为MARKER，后面的是师姐的。
问题
1、左两道似乎就没有蛋白？但我提完是测过的，18。
2、有几条带横断整块胶，似乎是干扰，到底是怎么出现的？（有位师兄说是蛋白不够纯，加样时离心一下就好了，我今天打算试一下）
3、最下面的团状形态是如何形成的？
4、我试过脱色过夜，跑道上的颜色仍脱不理想，有谁还有好办法？

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【求助】胶跑成这样子有谁见过?

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taoshengyijiu (2014-4-14 16:08:13)

你好，看了这个帖子和你上次提蛋白的帖子，我还是怀疑你的蛋白测量仪可靠性。个人感觉那种仪器很可能是280定量，准确性是不够的。用bradford或lowry那样才让人放心。你的电泳图也证明了蛋白定量是不准的。
2. 你的师兄的观点好奇怪啊，不知是你表述问题，还是他逻辑问题。蛋白不纯为什么离心就ok了？出现横带这个其实影响因素很多的，比如配胶时是否混匀？拔掉梳子后有没有纯水洗掉多余液体？电泳缓冲液有没有问题？
3.团状的倒是比较容易出现，某个分子量区域蛋白含量较大（比如质粒表达某个蛋白）就会出现团状。
4.染色时间不要太长，一般一到两个小时足矣，脱色过夜。
此外，因为边际效应，胶左右各留出两个泳道，只加loading buffer，不加蛋白
wu11998866 (2014-4-14 16:08:32)

重新配电泳缓冲液试试,我们以前也有类似情况,换了就很漂亮了
PCR (2014-4-14 16:09:56)

谢谢各位指导。
电泳图也证明了蛋白定量是不准的——是不是说我的道上没蛋白？
配胶时我一次采用的是用枪吹打，一次是摇匀……不知道有没别的办法？
拔掉梳子后有纯水洗掉多余液体。
至于电泳缓冲液我们这里内槽是用新鲜的，外槽是用回收的——大家都这么做，应该没问题。至于缓冲液本身——那我重配吧。
谢谢！！
kuohao17 (2014-4-14 16:10:13)

胶有问题啊，丙烯酰胺是不是不纯？
zhezhe (2014-4-14 16:10:48)

这个现象是电泳缓冲液重复使用的次数太多造成的，换新的电泳液就正常了！我以前就碰到过这种情况。
tie8 (2014-4-14 16:11:04)

我今天也跑了个怪胶，样品呈弥散的竖条，Marker正常，其中样品中有一个是想用来做阴性对照的BSA，是用新配的电泳液~，请各位高手分析一下有哪些原因造成
shenkunjie (2014-4-14 16:11:22)

是不是胶有问题，制胶时不能产生气泡
另外是不是跑电泳时电压使用太大的事，我前两天做的积层胶时设定电压80V,分离胶时改为150V，结果电泳跑出来的结果就是条带很宽，后来重新做了一次先是60V，后为80V，跑出来的条带比较正常了
redbutterfly (2014-4-14 16:11:57)

又跑了几次,大家看下吧

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PCR (2014-4-14 16:12:21)

原来的问题没有了,出了新问题,有竖线干扰
ffaa (2014-4-14 16:12:44)

原来的问题没有了,出了新问题,有竖线干扰

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竖线是背景吧，样品加上样缓冲煮沸后可以再离心，然后取上清加样
DONT (2014-4-14 16:14:47)

楼主存在的问题主要有三个:
1. 存在核酸或脂类等一些不溶物质的干扰,
主要表现是竖线,甬道条带间边界模糊,
提的是细胞还是组织的蛋白?照理说组织蛋白由于匀浆或研磨,很少出现核酸的干扰.那么极有可能是脂类一些不溶物质,如一些富含脂类的组织脑组织等,
2. 四五甬道上样量过大,表现为一团大大.
3.胶混得不均匀,就是为什么下面有奇形怪状的条带.
所以配胶时尽量用枪头混匀.
给你看一块胶,转膜后的,一二甬道是细胞株蛋白,样品质量明显不好,其余几个是研磨的主动脉组织,条带整齐,边界明显.
另外给你一个建议,帮别人带着跑蛋白时,最好另跑一块胶,因为样品蛋白浓度,离子浓度的不同很多时候会出现问题,如条带挤压等等.

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PCR (2014-4-14 16:15:15)

谢谢各位指点，胶跑成了，但所需蛋白条带不明显——这些倒还能容忍，可转膜用丽春染后发现只有MARKER，其他什么也没有，感觉很干净的样子……唉……
eve_49 (2014-4-14 16:15:36)

1。核酸类干扰。
2。不溶性杂质干扰。
3。样品盐浓度较高。
4。配置胶的水不纯或胶凝固不好。
daod (2014-4-14 16:17:52)

你蛋白条带不明显还转膜?!转膜的结果只会使带更不明显!
am10 (2014-4-14 16:18:09)

我几次跑胶的时候中间也会出现一条横线，其它都很好。
原来是胶没有混匀的缘故，下回再试一试。