【求助】一抗保存问题

最新回复

• 49888 (2014-4-15 08:57:22)

  
  4度或冻存都问题不大的，甚至有的一抗可以重复用4、5次的。不过wb影响因素很多，不知道你的阳性对照怎么样？不妨用新的一抗来做一下，看看是不是这个问题。

• 101010 (2014-4-15 08:57:42)

  
  谢谢，你这样说我放心多了，刚才心虚的很哪。我刚开始做wb，做了有5次了。就是先做内参β－actin，就当练手，我不知道***作过程有没有问题，还有就是抗体稀释的问题，一抗按推荐的1：1000稀释，二抗1：10000，不知道浓度是否太小了。
  转膜条件：bio－rad公司的mini trans－blot electrophotetic transfer cell,100v 40min
  转膜完，用含5%牛血清白蛋白（用TBST配制）的封闭液封闭30分钟，之后用上述一抗常温孵育90分钟。洗膜（TBST 10min 2次，TBS 10分钟 1次），用二抗常温孵育90分钟，同上洗膜。DAB显色。
  膜是PVDF膜，一抗是鼠单抗，二抗是羊抗鼠，HRP耦联。蛋白是细胞（HT－29人结肠腺癌细胞）中提的总蛋白（裂解液用的是碧云天的）。您再帮我看看上述步骤有没有问题。
  非常感谢

• 49888 (2014-4-15 08:58:03)

  这个过程是没有问题的，不过一般wb一抗、二抗比例是需要做个梯度来比较一下的
  另外，样品本身的性质也很重要，必须要有阳性对照。因为我不知道你以往具体是什么结果？是什么都没有？还是条带不明显等等，我觉得可以先用阳性对照来做个梯度实验

• 101010 (2014-4-15 08:59:10)

  
  我做的5次都显色都没有条带出现，不知道是什么原因，封闭时间短的话有关系吗，我准备这次4度过夜封闭看看。您说的阳性对照怎么做的呢，还有个问题就是，稀释好的抗体能4度能放多长时间呢，非常感谢

• greenbee (2014-4-15 08:59:33)

  
  单抗一般出结果难一些，个人建议你一抗的浓度加大一点，37℃1小时或4℃过夜，封闭时间单抗的话半小时也行，4度过夜封闭时间太长了，更不利于出结果，二抗浓度也可到1：5000，37℃1小时或室温2小时；另外最好同时做内参，以排除总蛋白含量，转膜及染色的问题。另外其他原因如一抗识别目的蛋白的位点（蛋白需不需要变性），转膜是否充分（有否过转）都要考虑。
  多摸一下，有好的结果反馈一下，呵呵，相互学习！

• 101010 (2014-4-15 08:59:58)

  
  昨天再做了一遍，DAB染色还是没有条带出现啊，郁闷了，高手指点下啊

• zzzz (2014-4-15 09:00:17)

  
  找个好奶粉吧

• 101010 (2014-4-15 09:00:35)

  
  做了很久的WB了,现在回来说下,抗体没有什么问题,能够跑出条带来,而且条带效果不错