【求助】关于GLUT-4的实验

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-4-15 11:38 作者: 考拉乌拉拉来源: 分析测试百科网

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【求助】关于GLUT-4的实验

我是新手,现在准备做犬GLUT-4的蛋白印迹,有几个问题想高手解答一下,
第一,蛋白的分子量是多少,论文上面找不到,
第二,我做的心肌组织,蛋白裂解液的配方是撒
希望高手能解答一下,也希望做GLUT-4的朋友们能进来说说话,谢谢

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最新回复

ALALA (2014-4-15 11:38:44)

不同种属不一样，介于45-55k之间
我做过骨骼肌的glut4检测，不过我采用的是方法是先匀浆，然后再用差速离心的方法得到细胞膜，再把细胞膜用sds溶解得到的样品
但我也听说用蛋白裂解液能做出来的，你可以先试试用RIPA裂解液
另：你的抗体是那个公司的啊？
fei1226com (2014-4-15 11:39:08)

小弟当年在台湾台北市立体育学院运动生化实验室()做的是Zuker鼠骨骼肌和心肌的GLUT-4,有几个重要的步骤跟战友分享一下:
1.裂解液用的是HES buffer:
HEPES 20 mM/L,EDTA mM/L,蔗糖 250 mM/L,溶解后调节PH值到7.4.
匀浆时标本的重量跟裂解液的比例为1:19.
2.电泳分离胶采用的是12%.因为GLUT-4分子量大概50 kd左右.
3. 转膜:半干转 10 v恒压30 min就可以(伯乐的仪器)
4.抗体是实验室郭家骅教授找他在美国的朋友要的(好象是美国佬的实验室自己合成的),质量特别好.记得当时和学长们几乎天天用这个抗体跑GLUT-4,反复冻溶竟然一点问题都没有,而且让人难以相信的是那100 ml的抗体工作液据说已经使用了3年多(如果我们能掌握这们技术估计SANTA 等公司都要关门了呵呵)!其他步骤就按照常规来就可以了.
战友们如果有兴趣可以访问台北市立体育学院运动生化实验室的网址,也可以跟郭教授请教这方面的问题呵呵cuturl('http://research.tpec.edu.tw/')
考拉乌拉拉 (2014-4-15 11:39:34)

谢谢各位的回答,我的抗体还没定,准备到SATAN公司联系,北京中衫是他的中国代理,
另外,这两天看别人做WB,觉得准备的东西比PCR多多了,我还是准备用蛋白裂解液,但是是自己配好呢还是买试剂盒呢,查论文又撒都查不到,简单几句话就说完了,配方也没说,请高手指点.
glass (2014-4-15 11:40:47)

QUOTE:
原帖由 fei1226com 于 2014-4-15 11:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

小弟当年在台湾台北市立体育学院运动生化实验室()做的是Zuker鼠骨骼肌和心肌的GLUT-4,有几个重要的步骤跟战友分享一下:
1.裂解液用的是HES buffer:
HEPES 20 mM/L,EDTA mM/L,蔗糖 250 mM/L,溶解后调节PH值到7.4.
匀 ...

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楼上的兄弟，我不是已经说了裂解液的配方了吗？用ＨＥＳ　buffer是没问题的，北体的网站上也能找到他们做ＧＬＵＴ４的ＷＢ的详细步骤，建议你去下载下来好好学习一下．郭老师的运动医学实验室每年发表的ＳＣＩ大概都在５篇，影响因子２分以上，他们的文章应该对你做ＧＬＵＴ４的wb或者ＰＣＲ很有帮助．在pubmed里面输入ＧＬＵＴ４，Ｔaiwan应该可以找到好多他们的ＳＣＩ　paper的．祝你顺利！
考拉乌拉拉 (2014-4-15 11:41:08)

请问高手的抗体在那里买的?
chuntian1983 (2014-4-15 11:42:06)

建议不要买santa的，可以买r&d 公司的
考拉乌拉拉 (2014-4-15 11:42:25)

我的抗体被我误冻了几天,个位有过这样的经历没?做的出来不?
考拉乌拉拉 (2014-4-15 11:43:11)

老兄,你的HES buffer中加的蛋白抑制剂是什么?加多少?
还有你的HEPES在那里买哦的