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【求助】大分子量蛋白转膜

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-15 21:24    作者: 孢子11    来源: 分析测试百科网

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【求助】大分子量蛋白转膜

请教各位:
我做的是140KD的蛋白,几次都没有结果.同样的样品内参(50KD)做出来了.
140KD的蛋白6%＆8%的胶都跑过,转膜是70或80分钟,半干转(BIORAD),10V,0.45的PVDF膜.一抗1:200,看不见荧光,也压不出带.
但是免疫荧光做出来了.
不知是怎么回事,郁闷啊.
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最新回复

  • sunbent (2014-4-15 21:25:29)


    分子量太大了,试试湿转吧.

  • kswl870 (2014-4-15 21:25:57)


    我做过170 kD和120 kD的蛋白Western。都做出来了，140 kD的蛋白不算是大分子，只能算一般的分子，应该是比较好做的。不过我转膜用的是湿转。如果你有湿转电转槽的话，可以试试25 mA恒流过夜（12 h）。
    此外，显影也应该提醒你。
    一般actin在暗室是可以看到荧光的，但是大部分蛋白由于表达量少是看不到荧光的。这种情况下，首次曝光请用3min，因为ECL荧光会很快淬灭。至于actin，你就算过1个小时再去曝光也是没有关系的。
    还有问一下你所购买抗体的厂家，你的抗体是否可以检测Western？虽然大部分抗体是能做免疫组化就能做western的，但确实有少量抗体只能做免疫组化，不能做western.

  • am10 (2014-4-15 21:27:11)

    140KD的蛋白6%＆8%的胶都可以，那个BIORAD的半干有点难转的，可以试试15V*2h。转完了用丽春红染下看看。祝好运！

  • flyxx05 (2014-4-15 21:28:26)

    半干转的方法,你可以试试18V* 35min ,我以前做过160kD左右的很多种,都很顺利

  • 911 (2014-4-15 21:29:27)

    你检测170KD分子的蛋白用的是什么条件，我也准备做这么大的蛋白，是新手，没经验，恳请你多给些建议。另外，我现在正在做SDS－PAGE，实验室的老师都说没必要做蛋白定量，认为通过调节样本的稀释比例，能跑出较均一的条带就可以了，你觉得是这样吗？非常感谢。

  • vtongli (2014-4-15 21:31:29)

    这个分子量用半干和湿转都是没问题的，建议用预染marker监测一下转移程度。

  • 孢子11 (2014-4-15 21:32:15)


    没有爆出来，原因有很多，不一定是转膜的问题。140kd，分子量不算大，6%或8%的胶都可以，半干转肯定是没问题，你用10v的话，当时电流怎么样，你再优化一下条件，用个预染marker做一下标记，试一下170ma，90min，我用上述条件转160kd也没问题。还有抗体的问题也是很重要的。再试试吧。

  • H2O (2014-4-15 21:33:05)


    我做的事170KD的蛋白，转印后用考染胶上还是有条带，立春红染膜上也有条带。我用的是300mA,90分钟，请问zhangdan982你用什么方法转膜较彻底？怎么做才能使电泳槽的温度维持在4度？谢谢。
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