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【求助】原核蛋白表达问题 ?

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-15 21:34    作者: october7    来源: 分析测试百科网

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【求助】原核蛋白表达问题 ?

Smile 求助各位高手: 初次尝试原核表达, 为什麽小妹做的 pet28b-egfp in bl21 iptg 诱导总不表达? 质粒测序结果正确,也尝试过不同温度 时间梯度的诱导表达, 但sds-page 看不到诱导效果, 请大家点评.......
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最新回复

  • changlhsyo (2014-4-15 21:34:50)

  • viviwang1987 (2014-4-15 21:35:12)


    楼主用的是pet28b载体表达egfp,我用的是PQE30载体表达绿色荧光蛋白,刚开始遇到了同样的问题,蛋白诱导表达后,跑sds-page什么也没有,不过最后发现我的目的蛋白由于是以包含体的形式表达的,在跑电泳之前,超声破菌没做好,直接煮沸后就上样了,没看到目的带.下次超声后目的带就很明显了.
    仔细看看自己的每一步.
    楼主也可做个western,用抗his的抗体做一个,
    或者用荧光显微镜看看也可以,

  • damingxia0904 (2014-4-15 21:35:44)

    楼主用的是pet28b载体表达egfp,我用的是PQE30载体表达绿色荧光蛋白,刚开始遇到了同样的问题,蛋白诱导表达后,跑sds-page什么也没有,不过最后发现我的目的蛋白由于是以包含体的形式表达的,在跑电泳之前,超声破菌没做好,直接煮沸后就上样了,没看到目的带.下次超声后目的带就很明显了.

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    我觉得楼上的把因果弄反了,应该是先跑PAGE电泳,确定有没有蛋白表达,然后再做可溶性分析,看是否是包涵体还是可溶性表达

  • damingxia0904 (2014-4-15 21:36:31)


    是啊,包涵体也是能通过SDS-PAGE检测到的啊.

  • iii_ii (2014-4-15 21:36:51)


    那就是说蛋白诱导表达后,离心收集菌体,煮沸上样电泳就可以了吗?只要蛋白表达,就可以检测到吗,无论包含体好是可容的形式.
    我做的客观事实是超声前没有,超声后检测到了,

  • 马大牙 (2014-4-15 21:37:17)

    你好,我做的客观事实是:WB检测目的蛋白,超声前量很多,超声后量很少(内参无变化).并且我做过的所有原核表达蛋白(不下20个)都有这种现象.

  • tianmei001 (2014-4-15 21:38:24)

    看表达量，用SDS-PAGE分析没有必要破胞

  • october7 (2014-4-15 21:38:54)


    啊,不会吧,我们实验室原来一直是这样做的啊,可容的蛋白跑sds-page前是不用超声了,包涵体的蛋白我们一直是先超声,后上样电泳的.
    刚开始没诱导出来的时候,导师还一再提醒我是否超声完全,没有必要的话为什么我超声后他就出来了呢?
    我下次做个对比看看,验证一下.
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