【求助】细胞膜上的蛋白裂解有什么较好的方法吗？

最新回复

• orangecake (2014-4-16 15:12:13)

  
  我也在做细胞膜上的蛋白的western，也是烦恼这个问题，后来请教了碧云天公司的技术人员，他们建议10000转离心完了把沉淀再裂解一遍后再煮了也加到上样孔中，可以试试，我反正是没试出来。祝你好运

• PINK (2014-4-16 15:13:27)

  我们做过膜蛋白wb，细胞可以先用匀浆的方法破碎，然后700g离心去核及未破碎的细胞，然后把上清再用30000g左右离心，获得沉淀再用10％sds溶解，sds的体积自己控制，比较好溶解的，跑胶的时候上样不要煮，直接加loading buffer 就ok了，祝好运

• fsdd817 (2014-4-16 15:13:48)

  楼上的同志，请问跑胶的时候上样不煮是为什么？我们做WB时都会在SDS溶解后再煮几分钟的。

• gogo (2014-4-16 15:14:20)

  
  1.我们做膜蛋白都是用MERK公司的KIT（cat ：444810），贵！但提出来的膜蛋白还行。
  2.膜上的蛋白多是受体之类，估计一煮就破坏立体结构了，可能影响研究。
  3.我看到论坛里有人推荐用7M urea,2M thiourea,4%CHAPS,2.5%SB3-10裂解后冰上30min，4°C高速离心30min，取上清即可。有国外的文献也称全细胞裂解液离心后的沉淀可以用7M urea,2M thiourea，1.5%ASB-14加蛋白酶抑制剂来重悬得到膜蛋白。

• orangecake (2014-4-16 15:14:39)

  
  做膜蛋白最好不煮，煮完以后就条带变的很模糊，拖尾现象很严重。至于为啥呢，有师兄解释说是因为细胞膜有很多脂，加热后会影响脂的的性质，从而影响到蛋白的电泳行为，反正事实就是不煮更好些