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【求助】做WB快三个月了,就是做不出来！
以前做ERK1/2挺顺利的,刚开始杂带较多,那样调整一下抗体浓度,好好洗膜也就可以了.可现在做Notch1,HES1,Mash1(Ash1)死活都做不出来,比如Notch1,我们要测NICD片段,即胞内片段,分子量120KD,采用8%胶,MARKER跑得挺好的,最后拍照时在小分子位置约30KD处有很淡的带,而目标位置没有任何条带,我看抗体说明书,抗体可以检测Notch1 precursor,mature Notch1,Noth1 Next,及NICD片段,难道我测出的条带是其中的比如Noth1 Next,但NICD才是有活性的,即我们要检测的,而且这次裂解细胞我采用了如下 的方法.【求助】做WB快三个月了,就是做不出来！
1.将细胞收集到EP管中，离心（4000r/min，5min，4度)。
2.用预冷的5mLPBS洗一次，离心同上，弃上清。
3.悬浮在缓冲液A 100-150μl中
(10 mmol/L Hepes,pH 7.9，
10 mmol/L KCl,
0.1 mmol/L EDTA,
1%NP-40,（较温和）
1 mmol/L DTT,
0.1 mmol/L PMSF,
1 mg/L Leupeptin、aprotinin和pepstatin)
混匀后冰置15 min,
剧烈震荡15 s,13 000 r*min-1、离心10 s
仔细吸取全部上清，为胞浆蛋白-80℃保存备用。
4.加入50-100 μl缓冲液B
(20 mmol/L Hepes,pH 7.9，
420 mmol/L NaCl,
0.1 mmol/L EDTA,
1.5 mmol/L MgCl,
25% glycerol,
1 mmol/L DTT,
0.1 mmol/L PMSF
1 mg/L Leupeptin、aprotinin和pepstatin)中
冰置30 min，剧烈震荡15 s，4℃、12 500 r*min-1离心10 min,取上清
这个裂解配方也是在园里看了很多少帖子总结出来的.有个疑问即bufferB里面不含有NP-40,什么成分裂核膜呢?
我分别定量胞质蛋白和核蛋白,浓度大约分别为40ug/l,15ug/l感觉浓度应当挺高的呢,但目的蛋白却检测不到,是不是什么所谓的蛋白丰度太低啊?丰度是什么?如何查呢?
抗体也不敢轻易怀疑,因为这三个蛋白都做不出来,总不能都有问题吧!
有没有专门卖纯蛋白的,比如Noth1,也好做个阳性对照 ,(对抗体不敢轻易怀疑,也不完全信任),另外抗体说明书上往往提示某种组织抽提液可做阳性对照, 这个我昨天刚看到不知大家常用这个法子吗?
快要愁死了,再拿不出结果,没法跟导师交待,假期也过不好>_<
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最新回复
finger (2014-4-16 15:28:05)
“浓度大约分别为40ug/l,15ug/l，”
不知道你的单位是不是写错了，是不是“ug/ul”。如果是这样的话，我觉得你的蛋白浓度是不是太高了。
我匀的脑蛋白一般是3ug/ul，我们实验室有人匀肝蛋白是15ug/ul（胞质蛋白）。你的细胞蛋白能匀出这么多来，我觉得很奇怪。
“有没有专门卖纯蛋白的,比如Noth1,也好做个阳性对照”
许多常用的蛋白都是有纯蛋白卖的。我们同学做AQP4就用了纯蛋白。不过你就算有纯蛋白也没有多少用处，因为这个同学用纯蛋白做出来以后，又花了很多时间做组织蛋白。我导是建议你再做一下你的ERK1/2，如果可以做出来，至少说明你的系统是没有问题的。
如果你觉得你匀的蛋白没有问题，整个western系统也没有问题的话，不要害怕，直接向抗体公司质询吧！呵呵！
mod=8048 (2014-4-16 15:28:23)
不知道纯蛋白是不是很贵,我现在对自己的抗体也有些信不过了,想做个对照,看一抗有没有问题.ERK1/2仍然能够做出来,前两天刚刚又做了一遍.
还有那个什么蛋白丰度问题,我也一直搞不明白,哎!
最初怕蛋白的收集时期不对,可能某种蛋白已经表达完了,不是它的高峰时期,后来做了个时间梯度,比如说我们通常让细胞增殖6天,而我的蛋白收集就来个2d,4d,6d,但还是没有出来!!!
快要山穷水尽了,好心人来帮忙#_+
am10 (2014-4-16 15:28:40)
不太懂western， 不能在技术上帮助楼主，但是在精神上支持你。
别着急，多看书，多检索，多讨论，多思考，不怕苦，不怕累。
坚持，坚持……努力，努力……出结果也是迟早的事。
mod=8048 (2014-4-16 15:29:01)
请前辈们多多支持啊,我现在求救无门!
还是本楼一楼帖子里面的几个问题,红字部分,本园的大师级人物应该很多啊,不可能没有人知道吧?!
导师估计本周五就要回来了,拿什么交待啊!
fei1226com (2014-4-16 15:29:23)
胞质蛋白约为7-10mg/ml,而核蛋白约为3mg/ml,这个浓度不算低了，还可以说比较高呢，我的问题和你一样，300，52，34kd的次次都出来，21、15kd的总不出带，也怀疑是否一抗问题。我也想打听纯蛋白，做个阳性对照。
mamamiya (2014-4-16 15:30:01)
Buffer A：
1.0 M HEPES(PH7.9) 500ul
2.0 M KCL 250ul
0.1 M DTT 500ul
0.1 M EDTA 50ul
0.1 M EGTA 50ul
加蒸馏水至 50ml
Buffer B:
1.0 M HEPES(PH7.9) 1.0ml
2.0 M KCL 10ml
0.1 M DTT 500ul
0.1 M EDTA 50ul
0.1 M EGTA 50ul
加蒸馏水至 50ml
Buffer C :
100mM PMSF 用前分别加入Buffer A和Buffer B中，使其终浓度分别为1 M和0.5M
步骤：
1.收集细胞，PBS清洗，3000r*5min，重复3次，转移至EP管中
2.加150ul Buffer A（已加Buffer C）置冰上15min
3.加入25ul 10% NP-40
4.置螺旋震荡器上强烈震荡30s
5.12000r*3min, 4℃
6.去上清，用50ul Buffer B（已加Buffer C）重悬沉淀
7.4℃震荡45min
8.12000r*20min, 4℃
9.收集上清即为核蛋白提取物，分装，-80℃保存。
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但是我在用 Buffer B重悬时，不能溶解沉淀，已经反复吹打，后追加50ul Buffer B（已加Buffer C），吹打还是不溶，就用液氮反复冻融3次，每次2min，还是不溶，最后拿去超声碎裂才溶，不过蛋白浓度测定结果是基本上没有蛋白。
我的方案与楼主有些不同，请问楼主加完 Buffer B后，沉淀易溶吗？能不能告诉我你具体的配方和加入量？后者PM给我。我在加完NP-40后，发现有沉淀，不知道楼主有无此现象？同问Buffer B中是什么成分可以提出核蛋白呢？
我是第一次做WB，第一次提核蛋白，失败了，下次打算提总蛋白来做，这样也许会保险点，怕再失败，浪费原料。
mod=8048 (2014-4-16 15:30:20)
我在加完Buffer B后,沉淀也是不好溶解,小的枪吹打不开,然后我就用1ml的枪来吹打,还是容易吹打开的,我感觉之所以不溶,一是高速离心的原因,二可能是沉淀里有核吧.
我的配方就是完全按照一楼里写的那样.
我没有单独加NP-40,直接把这种成分整合到Buffer A里了,没有发现你说的那种现象.
我也失败了,没有什么好的经验,只有失败的教训*_+
remenb (2014-4-16 15:31:07)
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离心10s，这个怎么离啊？？
mod=8048 (2014-4-16 15:31:24)
我们那个小离心机可以离10s,但不是4度
any333 (2014-4-16 15:31:43)
ssonglikihi (2014-4-16 15:32:00)
虽然我自己没有做过核蛋白提取，但看了以上战友的问题，结合自己做western的经验谈点看法，希望有帮助。
1.不知道蛋白测定是否存在问题，楼主用什么方法什么试剂盒进行的蛋白测定？其实细胞蛋白能提取到这个浓度已经很高了，我怀疑是不是楼主的测定有很强的干扰因素，导致测定值偏高。尤其是蛋白样本不知测定时是否经过了稀释，如果没有稀释，0.1M的EGTA和EDTA足够引起干扰了。
2.另外一点就是对提核蛋白方法本身的考虑，我看了protocol，大概的意思是加了buffer A的作用是裂开细胞膜，离心沉淀细胞核，然后加buffer B溶解细胞核蛋白。但是BufferB里的成分没有去污剂，虽然没有去污剂也可以溶解一定的蛋白，但是楼主的蛋白浓度还能那么高我就觉得很奇怪了，所以才会怀疑你的测定方法。如果原理就是按照我推测的那样，为什么不在Buffer B里面多加一点去污剂呢，比如SDS或者NP40?
3.楼上有帖子说，包括楼主，都遇到了Buffer B不溶物的问题，我觉得很有可能是核酸物质，加一点DNAse会不会好一点呢？
最后，我们实验室有人做过核蛋白提取，用的是提取试剂盒，一下就成功了，试剂盒是国产的，价格就几百吧，你可以问一下代理。既然抗体都那么贵了，何必在乎这点试剂的钱呢？
mod=8048 (2014-4-16 15:32:26)
蛋白样品测定时没有稀释,0.1 mmol/L EDTA园里的帖子好多都是这个浓度,我想应该没有问题吧.
至于buffer B里为什么没有去污剂,我也不知道为什么?(生搬硬套别人的,园里有不少裂解核的帖子,都这样写)
buffer B里的不溶物,还没搞清楚*_^
shenkunjie (2014-4-16 15:32:54)
虽然你的各种试剂可能都在考染方法的兼容范围内，但是这些因素的累积还是会导致有较强的干扰，我建议你单用buffer B做一个看看吸光度是多少。我觉得你的蛋白浓度还是过高了，可能是你细胞比较多，反正我收的细胞全蛋白裂解一般也只有4－5mg/ml浓度的
ritou1985 (2014-4-16 15:33:12)
另外可能的原因是你所测蛋白在组织和细胞内的含量太低．
avi317 (2014-4-16 15:33:32)
我觉得要是有一个阳性对照就可以确定是不是抗体的问题了。这样的阳性对照可以是纯化的蛋白，也可以是瞬转293细胞或其它细胞的细胞裂解液。此外，如果怀疑蛋白抽提步骤有问题，不妨直接用loading buffer裂解细胞。
阿k (2014-4-16 15:33:50)
我刚开始做western，正在制备蛋白，我想问下，
1%NP-40,（较温和）
1 mg/L Leupeptin、aprotinin和pepstatin分别是什么啊？
小游abc (2014-4-16 15:34:19)
我提核蛋白的方法：
1药物不同时间作用后的细胞，用胰酶消化或用玻璃刮棒收集细胞，1100rpm离心5min，弃上清，用预冷PBS洗涤二次。
2 加1ml Lysis Buffer (6孔板每孔加0.5ml)，冰上孵育10min。
3 加25l 10％NP-40（6孔板每孔加12.5l），震荡10秒后冰上孵育30min。
4 12000rpm室温离心30秒。
5 弃上清，加100l Extraction Buffer（6孔板每孔加30l），冰上孵育20min。
6 4℃ 12000 rpm离心15 min，取上清液，Lowery法测蛋白质浓度后-70℃冻存备用。
Lysis Buffer:
10mM HEPES
1.5mM MgCl2-6H2O
10mM NaCl
0.5mM DTT
0.5mM PMSF
2g/ml Pepstatin
2g/ml Leupeptin
2g/ml Aprotinin
2mM NaVO4
临用前配制。
Extraction Buffer：
20mM HEPES
1.5mM MgCl2-6H2O
420mM NaCl
0.5mM DTT
0.5mM PMSF
0.2mM EDTA Na2-2H2O
25% Glycerol
2g/ml Pepstatin
2g/ml Leupeptin
2g/ml Aprotinin
2mM Na VO4
临用前配制。
阿k (2014-4-16 15:34:40)
RIPA是提细胞总蛋白的裂解液，我用它来制细胞质蛋白，会不会把所有蛋白都提出俩啊，线粒体蛋白会被提出来嘛？我是想分别制备细胞质和线粒体蛋白做western
mod=8048 (2014-4-16 15:35:00)
三个抗体Notch1,HES1,ASH1中,Notch1终于出结果了.
最初由于三个都做不出来,所以不敢相信自己运气有这么背(以为不可能三个抗体都有问题啊!)现在看来不相信也不行了.
我换了一个国产的抗体公司(天津赛尔生物科技有限公司cuturl('http://www.saierbio.cn/index/'))的Notch1抗体,竟然做出来了,而且我做了两遍结果应该是比较稳定了.
下次把我拍的照发上来.
正忙着投诉!
mod=8048 (2014-4-16 15:36:04)
只是我自己的想法,哪位高人知道,快来指教!
【求助】做WB快三个月了,就是做不出来！