【求助】一抗有问题？

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• abc816 (2014-4-16 15:54:08)

  
  你有特异性条带出现。说明抗体是认识目的蛋白的，
  条带多说明特异性不够强，有交叉反应
  应该从以下三个方面下手
  1。封闭，5％的脱脂奶粉封闭1小时，4度的话过夜，这步你应该没问题。
  2，就是一抗和二抗稀释度的调整了。二抗只要在厂家推荐稀释度上下各做一两个稀释度就行，而且一旦找到了稀释度以后可以固定二抗的稀释度，一抗稀释度就要多做几个。
  3，注意洗涤充分，5分钟1次，至少洗三次吧。最后就是曝光时间
  如果以上都做到了还是有些条带去不掉，那就是一抗不行，不够特意了。
  我看了楼主的问题了。从你的描述来看，你的二抗浓度合适，问题应该出在你的一抗上面。
  如果随着你稀释度的加大，特异性和非特异性条带都减弱的很厉害，那就说明抗体特异性确实不好。这就没有办法解决了

• jrwyyplt (2014-4-16 15:54:26)

  
  我同时作的另外一个抗体，用的同样浓度的二抗　背景就没有那么黑，还比较清楚，就是稍微有点花。那是不是说明我的这个一抗的浓度需要调整或者一抗有问题，二抗没有问题呢？

• jrwyyplt (2014-4-16 15:54:48)

  另外，做多克隆抗体出现的非特异性条带会比单克隆抗体多吗？为什么我的多克隆抗体总是有那么多条带？那在加二抗之前需要用牛奶封闭吗？我们实验室好像没有说要再封闭一次，他们一般在第一次加一抗之前封闭，之后都没有再封闭了。我真的是急死了，做了很多就是不行。

• jrwyyplt (2014-4-16 15:55:11)

  
  我的二抗用的super ECL, 浓度是1:100,000 实验室都是这么用的。不知道我需要怎么调整呢？

• 66小飞侠 (2014-4-16 15:55:28)

  
  特异性条带多还是非特异性条带多？
  降低一抗浓度试过吗？可以试试调整浓度
  TBST有问题没？可以试一下PH8.0的TrisCl，Tween的浓度多大，我们加到0.1％，洗的时候15',5',5',5，一般没问题的
  加二抗前不会再封闭一遍，因为二抗本身就是加在封闭液里的
  对了，blocking Buffer和 TBST最好是一批的，而且最好都是新鲜配置的

• DONT (2014-4-16 15:55:52)

  这些应该都没有问题　因为我同时在帮别人作的抗体就比较好。所以主要还是我的抗体的问题，二抗浓度都是用的一样的，就是一抗不一样。所以我觉得还是我一抗的问题。是非特异性条带多，目的条带也看得到。降低一抗浓度可以降低背景吗？我下次试试。

• u234 (2014-4-16 15:56:10)

  
  如果降低了一抗浓度还达不到满意效果的话，可以尝试换一种封闭剂，如果以前用脱脂奶粉，那么可以用用BSA。

• jrwyyplt (2014-4-16 16:01:34)

  
  问题是我是整个背景都是黑的，本来一抗就不突出，再降低浓度会不会就看不见了？这里都用的是脱脂奶粉啊。对不同的抗体　封闭剂也应该调整吗？请教

• bring (2014-4-16 16:01:53)

  原因：1.HRP浓度过高
  2.封闭无效
  3.不适合的封闭试剂
  4.洗涤不充分和洗涤液的量
  5.胶片曝光过度
  6.抗原或抗体的浓度太高
  解决方法 1.稀释HRP至少10倍
  2.寻找合适的封闭方法
  3.选用其他的封闭试剂
  4.增加洗涤的时间,次数
  5.减少曝光时间
  6.稀释抗原或抗体