【求助】western 没有结果，为什么啊？

最新回复

• 131415 (2014-4-16 16:10:56)

  
  配置ECL的时候不必要在黑的环境，但是曝光必须在暗室。
  看来还是你的转膜有问题，再好好摸下条件，园子里有很多wb的精华帖子好好学习一下吧。
  抗体浓度其实一般不用那么高的，不过具体还是要看情况。
  祝你好运！
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=5936631&sty=1&tpg=1&age=-1')

• 3648755 (2014-4-16 16:11:23)

  
  无论配置还是加入ECL都要在黑暗中进行，我曾经试过，二抗稀释2000倍放到一个EP管，加入一定量的ECL a液和b液，如果黑暗条件下，2 分钟后还能出明显的荧光，但如果在日光灯下，10秒钟就什么也看不见了。
  从zxfgly的问题中，我觉得你对黑暗在western中的重要性认识远远不够，所以你出现的黑片，我就认为很可能让你曝光了。有些全黑有些全无，说明胶片本身质量是没有问题的。出问题的是你在取胶片或者裁胶片过程中接触光了。
  “转膜时有时只转过一条带”，是不是指你转完膜后立春红染只有一条带。这样问题就更大更多了，说明你跑电泳转膜都可能出问题了。
  此外还得指出monde说的不太正确的地方，每个公司抗体的抗体稀释比都不一样，像sigma cst chemicon等大牌的一抗都是1：2000以上。但楼主的帖子已经说了，是santa的。santa的抗体效价低，所以体积大，1ml。而且santa推荐开始稀释比就是1：200，范围 1：100～～～1：500。
  综述所述，给楼主以下建议：
  1.不要急着完成western的整个过程，这样只会重复错误，一步步查。
  2. 首先，跑胶，考染看看，胶上条带是否正常。如果正常进入3。
  3. 跑胶、转膜。完成后膜用立春红染，胶用考染，看看蛋白是没转过去还是转过头了。以此为依据，调整转膜条件。
  4.得到完整的膜后，先做内参，如果膜是完好的，而ACTIN或者GAPDH显不出来，要一一排除ECL、胶片、显影定影液，和你操作哪里出了问题

• linlinstar (2014-4-16 16:11:45)

  
  我的western也是今天才出的结果，不过我算幸运的，做了一周。我的体会：曝光这一步必须在暗室中进行。如果实在不方便，用较暗的红灯也是可以的。我们就用一小手电，过上好多层红塑料。加入ecl在黑暗条件下更好，因为荧光淬灭得很快。相对来说内参更好做出来，不在黑暗条件下也行。但是我们的目的条带往往由于一些制样、转膜等原因，荧光向对来说要弱，而x光片时需要荧光来曝光的，所以加入ecl后要以最快的速度压膜，越快越好。做western最困难的三个环节：制样、转膜和曝光。曝光这一步我今天全部在暗室中进行，偶尔用一下小手电。你首先要保证转膜成功，转膜后用丽春红染一下，看有无蛋白条带。转膜条件是要根据目的蛋白摸索的。我做的蛋白分子量170-175kb.大家都说不好做。我用半干转18伏60分钟，做出来了，所以别灰心，找好原因，继续做。祝好运！

• qhyu (2014-4-16 16:16:28)

  考染之后的胶，还可以用来转膜吗？

• qhyu (2014-4-16 16:16:50)

  我做的是大鼠子宫雌激素受体的表达，我看文献得知这个表达量还挺高的，但我做不出来，也不知道哪里有问题，新手，还多都不懂，我的步骤如下：电泳，上样30UL,100V，大约2小时；我的目的蛋白是66KD的，转膜，150MA，1.5小时；脱脂奶粉封闭1小时；一抗一小时，TBST洗三次，第一次15分钟，后两次5分钟；二抗一小时，TBST洗三次，第一次15分钟，后两次5分钟；加ECL发光底物3分钟，押片5分钟，显影5分钟，定影5分钟，结果就像上面一样，哦，好灰心哦，大家帮我分析分析是哪里有问题啊！

• 00无名指00 (2014-4-16 16:17:04)

  
  考染之后不能转膜了。我建议你考染一下，是因为你第一帖里硕说膜时有时只转过一条带，所以让你从头开始确认哪个步骤出错了。
  从你上个帖子看你的步骤，感觉问题还不是一般的多。真不知道这些数字你是哪里看来的。问题一一例举如下：
  1.你电泳没有浓缩胶和分离胶嘛？统一100 v？
  2.封闭时间感觉少了，2小时比较保险。封闭时静止还是摇床？
  3.一抗时间为什么那么短？室温一般也要2～4 小时，冰上则要过夜
  4.发光底物为什么要3分钟。我个人的感觉是santa的ECL不是增强型的，1～2 min时效果最好。
  5.压片为什么是5 min，这个得根据你看到的荧光强度而决定，不是时间越长越好。如果荧光条带明显，不超过一分钟比较好。如果看不到，可以试试3～5分钟。出不来就是出不来，延长压片时间是没有用的。显影和定影也不该有确定的时间，看到条带出来了，且快要衍射时赶紧捞出来。
  老实说，zxfgly你是在准备很不充分的情况下开始western的，这样当然不会有好的结果。好好看两本介绍蛋白电泳的书，仔细对比你做的步骤，然后从头验证，看哪一步或者哪几步出了问题。

• 8princess8 (2014-4-16 16:18:02)

  
  1、一抗我们一般都是过夜的，虽然好像说室温2小时也可以，但4度过夜好像更保险一点。
  2、转膜后可以用立春红染色看转膜有没成功，然后再用TBS洗掉，固定。

• wood533 (2014-4-16 16:18:24)

  
  一抗我比较倾向于4度过夜，或者大概9个小时以上的时间
  封闭我一般室温1.5h，不过1h应该也可以，不会出大问题
  二抗2h室温
  电泳和转膜的时候最好加上预染marker，这样可以实时监控电泳情况，而且可以知道转膜是否充分，我觉得转膜时间可能有点不太足够
  你上样前是否做过蛋白定量？你的上样量有多少？通常要几十个微克。丽春红染色能不能出来比较好的条带？
  从压片直到定影结束之前，都必须严格避光的，如果你的蛋白丰度高，建议你试试看用DAB的系统，DAB是显色底物，灵敏度不如ECL，但是无需暗室操作，对新手来说比较容易上手。

• birdfish (2014-4-16 16:18:48)

  
  电泳时有浓缩胶和分离胶，但我统一用100V跑的，难道浓缩胶和分离胶跑电泳时的电压是不一样的吗？
  封闭用的脱色摇床
  我用的是pierce的蛋白定量试剂盒，上样的总蛋白有30ug,电泳时用的预染marker，MBI的，
  我的错误如此之多，谢谢大家帮助，非常感激大家

• birdfish (2014-4-16 16:22:53)

  
  电泳时有浓缩胶和分离胶，但我统一用100V跑的，难道浓缩胶和分离胶跑电泳时的电压是不一样的吗？
  封闭用的脱色摇床
  我用的是pierce的蛋白定量试剂盒，上样的总蛋白有30ug,电泳时用的预染marker，MBI的，
  我的错误如此之多，谢谢大家帮助，非常感激大家

• birdfish (2014-4-16 16:23:09)

  
  为什么转膜后预染marker只有一条带转到膜上去了呢

• taoshengyijiu (2014-4-16 16:23:26)

  
  哪一条转上去了？
  胶上还有哪些分子量的预染marker条带？
  转完膜以后也可以把胶用烤马斯亮蓝染一下看看

• birdfish (2014-4-16 16:23:48)

  看上去很亮，分子量较最小或者最大的那条，我没太注意，胶上也没有预染marker的带了

• ladyhuahua (2014-4-16 16:24:03)

  
  ...
  不重视观察症状，怎么去分析问题啊……
  要么会不会转过头，要么会不会你的膜有问题，要么你的缓冲液问题，要么大小不对有点短路诸如此类

• avi317 (2014-4-16 16:24:20)

  
  浓缩胶80伏，约30分钟，待溴酚兰跑入分离胶，改为120伏，跑大约一个半小时，根据预染marker决定中止时间。上样量尽可能大些，最好能上到70ul.封闭1-2个小时都可以。一抗过夜孵育。你首先应从制样、电泳、转膜、显影等环节来找原因，看问题究竟出在那里。我一般压片5分钟，显影2分钟。不知道对你有无帮助？

• avi317 (2014-4-16 16:24:44)

  
  对不起，是70ug，打错了。