【求助】western结果求助，为什么是这样？

最新回复

• seagate (2014-4-19 10:28:54)

  
  1。上样量太大了；
  2。1,2-抗的浓度偏高；
  3。显影时间可适当缩短。
  以上3点我建议你按照1-3的顺序调整优化，一定能做好。

• ii077345 (2014-4-19 10:29:15)

  
  1.我上样量每道用40ug
  2.一抗说明书稀释比例为1：200-1：1000，二抗说明书建议稀释比例为1：500-1：2000。我所用的稀释比例为一抗1：500，二抗1：2000，这样的浓度还很高吗？
  3.我曝光时间5-10min都试过，结果都差不多。

• greenbee (2014-4-19 10:29:33)

  
  糖基化蛋白由于加上去的糖基的数目不同,
  在电泳中不会显示一条清晰的条带的,而是有些smear
  正常的
  不过这个图爆的比较难看
  一抗二‘抗不是问题, 电泳还可以跑的更好些

• ii077345 (2014-4-19 10:29:51)

  
  是蛋白没有跑开吗，还是电泳时间太长了呢？我用的是7％的胶

• flower-201 (2014-4-19 10:30:08)

  
  跑胶的时候溴芬蓝是成一条细线的么？这样的话条带曝出来会比较好看一点，我的个人经验。
  另外，根据你这张图来看，你的一抗二抗完全可以尝试说明书的最大推荐稀释倍数。有时候不一定要完全照说明书的，能出好结果最重要：）

• utt0989 (2014-4-19 10:30:25)

  
  求助：请问那里有专业带做Western的公司或者个人，现我们实验室有人需要做，价格可商量！

• ii077345 (2014-4-19 10:34:57)

  
  这段时间我又做了几次，结果和最初的差不多。
  一抗和二抗的稀释倍数已经到最大了，电泳我也尽量跑的更好（winnie5299的说法溴芬蓝是成一条细线），可是仍然得不到好的结果。
  都快急死我了，还可以调整哪些地方啊？

• glass (2014-4-19 10:35:44)

  
  溴芬蓝压成一条细线电泳就跑的好了?!
  到后来,溴芬兰总会压成一条细线的.
  问题是: 1. marker跑的好么?
  2. 转膜之后立春红染,蛋白条带整齐么?
  3. 怎么只有三个甬道有蛋白?难道只加了三个样本么?
  如果是这样的话,其他的甬道有没有用1X的loading buffer堵上?
  跑胶时,样本尽量对称加,而且各甬道离子浓度要均一,跑出来的条带才好看.

• 49888 (2014-4-19 10:36:06)

  
  这个结果蛮好的呀，糖蛋白是这样，由于高度糖基化而呈现smear状，你应该加点去糖基化的化合物来作用一下你的蛋白，看看能不能变成一条单一的条带，如果这样可以的话，说明现在这个结果是很好的，没什么好着急的。

• ii077345 (2014-4-19 10:36:31)

  什么样的化合物可以去除糖基化作用，用量多大，是加到裂解液中还是配胶的时候加入？

• ii077345 (2014-4-19 10:36:59)

  溴芬蓝压成一条细线电泳就跑的好了?!
  到后来,溴芬兰总会压成一条细线的.
  问题是: 1. marker跑的好么?
  2. 转膜之后立春红染,蛋白条带整齐么?
  3. 怎么只有三个甬道有蛋白?难道只加了三个样本么?
  如果是这样的话,其他的甬道有没有用1X的loading buffer堵上?
  跑胶时,样本尽量对称加,而且各甬道离子浓度要均一,跑出来的条带才好看.
  ......
  
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  我用预染marker，跑得挺好；
  转膜后立春红，蛋白条带还比较整齐；
  另外的泳道是其他样品，相同位置应该没有条带；
  跑胶时样本量不太对称，因为没有调整到蛋白浓度一致，为了蛋白量相同，上样量不太一样。但这个影响大吗，我做其他蛋白都挺好。

• flower-201 (2014-4-19 10:37:16)

  
  糖蛋白的smaer肯定是有的,
  看你的暴光图,我觉得这三个泳道好象被挤压了.
  下次有机会传张立春红染的膜,
  既然你的抗体是好的,又确实存在糖基化,还有什么好担心的,只要电泳跑的好就OK了.