【求助】关于转膜的一个小问题，谢谢

最新回复

• wsll (2014-4-19 10:43:34)

  QUOTE:

  原帖由 uaubc 于 2014-4-19 10:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  正在尝试半干转，89KD的我认为半干做有点太大了，但是应该还是有可能做出来的吧，请大家给我一个建议，转膜的条件，谢谢呵呵
  另外。我23KD的用三〇〇MA 半小时，可以么，非常感谢奥 ...

  我在读研究生时曾经用半干转膜仪转过176kDa的蛋白！
  对于蛋白大小与转膜时间有关--大蛋白就适当延长转膜时间。
  你说的300mA是指湿转吧？
  湿转效率与半干相比是稍微低一些，但是你说的这种情况是没有问题的！
  建议以后发帖时尽可能的把自己实验的背景和存在的问题讲清楚，免得各位战友帮你解决问题时的思路发生偏移。这样在很多情况下是虽然解决不了你的问题，但是浪费了很多资源。
  Good luck！

• uaubc (2014-4-19 10:50:39)

  呵呵，谢谢你，我说的300MA半小时，是干转，我个人认为条件太大了，呵呵，谢谢，我再摸索下：）

• wmp1234 (2014-4-19 10:52:12)

  我们实验室是用的Bio－Rad的半干转仪器，做的蛋白是82kD，转膜设定为10V，转40min，建议你转50－60min

• uaubc (2014-4-19 10:52:40)

  
  呵呵，非常感谢你，我尝试一下，对了。你铺几张滤纸啊，

• gemei0115 (2014-4-19 10:53:03)

  
  我以前就一直用半干法，条件是：
  恒流：膜面积×（1.8或2.0）
  时间根据蛋白分子量来定，建议你的转60min
  下面铺6张或3张半干滤纸，上面铺6张或3张半干滤纸

• douding66 (2014-4-19 10:53:24)

  
  相关疾病：
  盲
  我们　实验室用过北京六一的半干转仪器，恒流１００mＡ半小时，同时转大小为４＊６cm２的ＮＣ膜，跑的是６５kd，和４３kd的蛋白，铺三明治的时候上下两层各用一张ＷＨＡＴＭＡＮ滤纸，效果很好．但是用普通滤纸，即使５六张也没出来一个很好的结果．建议选用ＷＨＡＴＭＡＮ　滤纸，虽然多花点银子，但是省时省力呵呵（铺一层whatman滤纸绝对比铺５层普通的省工夫，而且就小弟的经验，只要whatman滤纸不破，反复利用也是没有问题，无论是湿转和半干转）
  另外建议大家不要盲目的跟从别人的转膜条件，好多时候由于转膜的仪器不同，条件大多是不同的，比如说伯乐的半干转仪器好象铺三明治的顺序和六一的刚好相反；还有更重要的是目的蛋白的分子量不同，采用的方式和条件肯定也是不同的，我们实验室１７０左右的蛋白均用湿转（六一的仪器，一般是２００－３００mＡ转２小时，），而小于１００kd的蛋白均采用半干转．特别是湿转的时候，我们用的仪器在横流２００mＡ转２小时的时候通常电压会从开始的时候由１３０Ｖ左右降到结束时的１００Ｖ左右，如果２小时快结束的时候电压降到了８０Ｖ以下，那我经常将时间适当延长到３小时以确保大分子蛋白完全转到了膜上．（至于电压在转膜过程中会降低园子里现在有人在讨论，大家有兴趣可以去看看）
  以上是小弟的一点经验，欢迎大家批评指正．