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【求助】western-blotting问题探讨
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大家好，感谢浏览我的求助帖，现在我做这个试验遇到了很到麻烦，请给点意见。本人做的是用pET28和pET32表达一个1300bp左右的基因，测序显示基因插入正确。于是开始做诱导表达。DNASTAR显示 N基因分子量大小是50kd,这样表达的pET28-N 应该是50kd大小，而pET32-N应该是70kd左右。这是用pET32-N第一次做的SDS-PAGE的图片。LANE 1：IPTG诱导过夜
LANE 2 IPTG诱导过夜
LANE 3 IPTG诱导5hour
LANE 4 uninduced
LANE 5 PET32-N菌液
LANE 6 PET32
LANE 7 BL21
LANE 8 marker ,99kd, 66.2kd, 43kd....
这里可能是污染了吧。因为空载体的阴性对照也出现了.
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最新回复
luoliqiong (2014-4-19 16:48:18)
理论上说66.2kd上方那条较粗的带是我想要的70kd目的蛋白带，于是做个western-blotting 检测一下。可是却在66.2与45kd之间出现了另外的带，而我的66.2上方并没有出现目的带，那出现的是非特异性带吗？如果是这样，那会是什么原因呢？是我的蛋白根本就没有表达出来吗？这个非常关键，因为下面做的几次都有这条带的出现
luoliqiong (2014-4-19 16:48:38)
因为我的导师很忙，几乎没有时间理会我们的试验，我的一个博士师兄建议我用pET28载体再表达一次，于是我又做了一次克隆，把N 基因连接到pET28载体上，通过测序pET28-N对筐也是正确的，接着马上开始诱导表达了。看图片吧，划红色线的就是我要的目的带,50kd左右。lane1-3:pET28-N(PCR样品2没有扩出N基因)
LANE4: uninduced
lane5:Marker 94kd,60kd,45kd,27kd,18kd
lane6:pET32 vector(怀疑被污染了pET32-N)
lane7:pET32 vector
lane8:pET28 vector
lane9:BL21
luoliqiong (2014-4-19 16:48:58)
lane4:bl21
lane5:marker 94,60,45,27,18kd
lane6:pet28-n
lane7:pet28-n
lane8:pet28-n
不论是载体、宿主细还是目的蛋白都在几乎相同的位置出现条带，而这又和上次pET32-N的western-blotting出现的大小几乎相同。到底是为什么呢？
85450681.snap.jpg
luoliqiong (2014-4-19 16:49:18)
当然了，大家得出的结果（包括导师）认为是：你污染了！
我的天，我是很小心的做的啊。但是我也初次做能懂什么，既然人们说污染了我也拿不出不是污染的证据，就算是污染吧，后面又做了好几次呢。包括点样的时候中间空一格（防止旁边孔里的没过去），这次的呢就是没点样的孔没有出现任何条带，就说明我加样是没有问题的，不会出现淹没过去的可能。但是我也尝试了纯化过两次，不知是什么原因，纯化后做SDS-PAGE，什么条带都不见了。
用pET32-N来做的纯化
lane1:菌体破碎的上清（检测蛋白是否主要以蛋白质的形式存在，所以要做）， lane2: 超声破碎的菌体（当然能见到那条70kd附近的带,但还是杂带很多，这里就要怀疑是不是表达了目的蛋白，见过别人超声破碎的，只有一条很粗的带，而我的并不明显，所以怀疑了），lane3：pET32 ,lane4:bl21 ,lane5:Marker 94kd,60kd,45kd,27kd,18kd . lane6:纯化后的，lane7:纯化后的 （什么都没有了）
64984022.jpg
luoliqiong (2014-4-19 16:49:37)
众人得出的结果是：没有表达出来，我也开始相信了，虽然我不愿意相信。
又重复了好多次从提质粒到酶切鉴定，到 PCR鉴定，到做感受态细胞，到转化，到诱导培养，重复到麻木了，呵呵。结果是一样的，那最后一次我拿的别的实验室的空载体（他处理好的，我只需点个样就行了），又做了次 SDS-PAGE和western-blotting,结果还是SDS-PAGE有疑似的带，而空载体和 BL21细胞没有，这很好，但是到了western-blotting确连同空载体和BL21细胞都出现了那条带。呵呵，图做的不好。
SDS-PAGE:lane 1:pET32-N , lane2:pET32-N, lane3:undinduced; lane4:pET32空载体; lane5:别的实验室给的pET32空载体. lane6:Marker 94kd,60kd,45kd,27kd,18kd .
lane6:pET28-N lane 7:pET28-N ;lane8:undinduced ;lane9:pET28空载体
44635118.jpg
luoliqiong (2014-4-19 16:49:57)
这张是对应的western-blotting图片。从右边数过来
lane 1:pET32-N , lane2:pET32-N, lane3:pET32空载体; lane4:别的实验室给的pET32空载体. lane5:Marker 94kd,60kd,45kd,27kd,18kd .
lane6:pET28-N lane 7:pET28-N ;lane8:pET28空载体 。反正现在在pet28-n该出现目的带的地方有条带出现，但是同样的无论是谁的载体也都有出现大小几乎一致的带，就不知道，这些带是不是统统都是非特异性的杂带。
22194823.jpg
luoliqiong (2014-4-19 16:50:14)
导师对我说你后面的也不用再做了，没意义了，你换个表达载体就是了。我还冀希望能纯化出来呢，还联系好了同学来帮我做一次，换换手气，可是说是不用再往下做了。大家能不能给分析下是什么原因呢？我都快疯了，因为这个表达做的太久太久了，都半年有余了，什么信心现在都没有了。
如果是换个表达载体的话用什么表达载体好呢，要不要考虑到密码子偏好性的问题呢
mamamiya (2014-4-19 16:52:07)
是蛋白的抗体
还是带的标签的抗体？
luoliqiong (2014-4-19 16:52:26)
用的是目的蛋白的多克隆抗体啊
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