【求助】包涵体奇怪状态

最新回复

• taoshengyijiu (2014-4-19 17:28:16)

  
  你这里所谓的“包涵体洗涤液”可能就是含有2-3M尿素或者盐酸胍的吧
  这样可能你的包涵体比较容易变性，在清洗的时候就变性了
  这是好事，一般来说，容易变性的包涵体复性也容易一点

• XYZQ (2014-4-19 17:28:32)

  
  应该是超声不彻底，从而没有使DNA破碎。
  原因：
  你的悬浮的体积太大了，建议用30ml悬浮，然后超声就可以了。

• eve_49 (2014-4-19 17:28:52)

  
  可能和发酵时表达的时间和温度有关系。 诱导时间过长出现胶联现象，温度过高也会发生胶联现象。

• =pkchen= (2014-4-19 17:29:22)

  QUOTE:

  原帖由 eve_49 于 2014-4-19 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  可能和发酵时表达的时间和温度有关系。 诱导时间过长出现胶联现象，温度过高也会发生胶联现象。

  不好意思啊，什么叫胶联的情况，这个会不会对我的蛋白有影响啊，会不会对后期的操作不利呢？

• fei1226com (2014-4-19 17:29:49)

  
  我觉得可能是菌液的量大，超声的时间不够，导致的菌体破碎不充分，可以将超声的时间延长或者将200ml悬浮体积减少，增加超声的时间，超声到液体清亮，然后再离心看看

• eve_49 (2014-4-19 17:30:12)

  出现胶联现象会使包含体不能在盐酸胍或尿素中完全溶解甚至不溶，从而导致复性率大大降低。另外很可能对蛋白的活性有影响。

• nut6694 (2014-4-19 17:30:48)

  我的蛋白是大肠杆菌表达包涵体，1.5L发酵，收菌后，用200mLTris缓冲液重悬，超声400w，5s超，5s停，超声30min，离心后包涵体是棕黄色，可是用包涵体洗涤液洗后，包涵体呈粘稠的糨糊状，能拉丝，是不是超声不彻底啊
  
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  不知道你收集的湿菌体有多少mg。一般超声体系悬浮液的固液比例按1:6（mg/ml）就可以
  超声是否合适，最好通过镜检来观察。以刚好全部超破细胞为止。
  正常条件下包含体离心后是致密的乳白色，洗涤和冻存后是褐色或棕红色。
  你离心后颜色发深，杂质过多，说明超声过度。而样品粘稠，可能悬浮液中细胞密度太浓。

• yychen (2014-4-19 17:31:26)

  
  你的菌体破碎不完全，不然不会出现黄色，黄色是菌体的颜色，一般来说，黏液状的是细胞膜变性裂解的状态。主要原因还是如同楼上所说的，超声时浓度太大，造成裂解不完全。

• =pkchen= (2014-4-19 17:31:55)

  QUOTE:

  原帖由 nut6694 于 2014-4-19 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我的蛋白是大肠杆菌表达包涵体，1.5L发酵，收菌后，用200mLTris缓冲液重悬，超声400w，5s超，5s停，超声30min，离心后包涵体是棕黄色，可是用包涵体洗涤液洗后，包涵体呈粘稠的糨糊状，能拉丝，是不是超声不彻底啊
  
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  谢谢老师的指导，但是我的湿菌重为10g，这样是不是要用6L buffer来重悬呢？这样体积是不是太大了啊

• cwcwcww (2014-4-19 17:32:17)

  
  我也出现过这种情况，我的菌体离心后放在4度一天后加入细胞裂解液呈黄色且很粘稠，但我超声波裂解后液体变清。我问老师，他说可能是我的包涵体较多菌体有部分裂解了，这是好事。