【求助】TCA－丙酮沉淀后如何调PH值呢？

最新回复

• greenbee (2014-4-19 17:36:38)

  
  我的蛋白也是用TCA沉淀的,如果TCA未除干净,溶液是偏绿的颜色,黄黄的我倒没遇见,可能是你TCA残留太多了吧.
  没做过双向,但是TCA不除净肯定对电泳有影响的,主要是拖尾,拖的厉害的时候会拱起个小峰,
  至于加NAOH调PH,我个人不建议,因为挺烦的,而且不好调.
  其实TCA很容易除去,关键是用acetone洗涤的时候要沉淀块打碎洗,洗三次,足够的,

• BUK (2014-4-19 17:36:57)

  我做酵母表达上清TCA的时候也遇到过LZ的这种情况
  分析原因，可能有两种：
  1、TCA残留过多，但是每次跑胶影响倒不是太大，加到PAGE加样空以后会把pH缓冲回来，颜色也回到正常蓝色
  2、酵母表达的话，可能是染菌，我发现我做的同一批TCA沉淀，绝大部分发黄的，那种金黄色，EP管底总是有一坨白色的絮状东西，SDS-PAGE后确认是染菌的。而正常的酵母上清沉淀是一个小颗粒，颗粒上方顶端是绿色，加溴酚兰后偶见发黄。

• cj_mondy (2014-4-19 17:37:28)

  QUOTE:

  原帖由 greenbee 于 2014-4-19 17:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我的蛋白也是用TCA沉淀的,如果TCA未除干净,溶液是偏绿的颜色,黄黄的我倒没遇见,可能是你TCA残留太多了吧.
  没做过双向,但是TCA不除净肯定对电泳有影响的,主要是拖尾,拖的厉害的时候会拱起个小峰,
  至于加NAOH调PH,我 ...

  我每次用TCA-丙酮沉淀后，再用丙酮洗涤三次，有次还洗了５次呢，可是还是一加到溴酚蓝里面就变黄，我怕洗多了蛋白质损失厉害。

• 逗号是句号 (2014-4-19 17:37:46)

  
  是啊,我刚开始做的时候,也是洗4,5次,颜色还是偏绿的,
  你每次洗的时候要将沉淀块打的很碎啊,然后冰上静置几分钟,等末末都沉下去了,再离心,再打碎洗,
  如果你简简单单的把大块沉淀冲一下,当然洗不干净了,
  而且打碎还有个好处,就是沉淀后蛋白更好溶,
  我现在加了buffer溶解,颜色都很好的,

• cj_mondy (2014-4-19 17:38:13)

  我刚刚又重新用丙酮洗了。我把丙酮加进去，然后用枪头把沉淀打碎，可是不管我怎么弄，那些沉淀就是分不开啊，更不用说有你说的那种末末了。那沉淀还可以拔出丝来呢。

• 逗号是句号 (2014-4-19 17:38:36)

  呵呵 不可能.
  是细胞蛋白么?
  你用刮子刮皿的 时候,就轻轻将它弄碎,
  洗的时候用枪头捣,吹当然吹不散了, 多捣几次,使劲捣,就会碎的
  放心去做吧,

• cj_mondy (2014-4-19 17:39:03)

  QUOTE:

  原帖由 逗号是句号 于 2014-4-19 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  呵呵 不可能.
  是细胞蛋白么?
  你用刮子刮皿的 时候,就轻轻将它弄碎,
  洗的时候用枪头捣,吹当然吹不散了, 多捣几次,使劲捣,就会碎的
  放心去做吧,

  歇息恩您的帮助！蛋白质加了水化液和溴酚蓝后呈现了淡蓝色，但是离心后发现底部有比较多的沉淀，不知道是不是蛋白质没有溶解彻底。现在还在跑一向，明天就可以看出来结果了。

• 逗号是句号 (2014-4-19 17:39:38)

  我不是做双向的,是用含尿素的缓冲液溶的,一般都室温溶解一个小时,
  是会有沉淀的,(最好放在室温离心,考虑4度下尿素可能沉淀析出)
  不过不用担心, 蛋白肯定溶了,
  要想溶解很彻底是不可能的饿，有一些蛋白特别是性质比较特殊如疏水性比较强的可能会丢失,

• cj_mondy (2014-4-19 17:40:01)

  实验图出来了，这是我第三次跑双向，自我感觉还行，：）。水化以后看到好多沉淀，还忐忑不安了一晚，怕没有蛋白点出来呢；除盐的效果也不错，没搭盐桥，电压也上了8000，准时跑完，比头两次跑得好多了，呵呵。不过扫描仪效果不太好，明天去台好的机子上再扫一次。
  
  现在的问题是，要去哪里找PDquest图像分析软件呢？

• utt0989 (2014-4-19 17:40:19)

  
  用百分之80的丙酮洗三次,每次30分钟,-20度.一般TCA都会洗掉.我就是这么做的.