【求助】怎样提高目的蛋白与NI柱的结合

最新回复

• ladyhuahua (2014-4-19 23:04:22)

  你试试pH8.0的缓冲液，你的蛋白质的结合时间是多长，最少要半个小时。
  你的诱导时间不要过长，这样杂蛋白就多了。

• uaubc (2014-4-19 23:04:41)

  
  我上样上了3次，结合时间有一个多小时，提高buffer 的PH会对结合有很大的影响吗？Nacl主要是起什么作用呢？会不会是Nacl浓度太高了呢？

• finger (2014-4-19 23:05:07)

  
  可能His-tag被遮蔽 或者表达不完全
  LZ用6M盐酸胍或者8M尿素破菌尝试一下

• uaubc (2014-4-19 23:05:41)

  我的蛋白是可溶性表达，如果加了6M盐酸胍或者8M尿素再去破碎菌体，那蛋白不就变性了吗？

• vcve (2014-4-19 23:05:58)

  
  将蛋白裂解液与Ni介质一起孵育，混合半小时，这样结合量会高些

• zbboom (2014-4-19 23:06:15)

  
  NaCl的作用是防止目的蛋白与杂蛋白（带异种电荷）、目的蛋白与载体间的非特异性相互作用，浓度500mM不算高，很正常。可以按照zjzjzjzj和riboenzyme办法试试。最好不要变性了再复性，损失是一方面，能不能成功复性都是问题。
  或者试试可不可以通过降低洗脱液pH的方法来进行洗脱。一般的目的蛋白从pH5.5左右（一般是4.3~5.5）开始被洗脱的，组氨酸残基质子化，与Ni分开。可以试试，不一定行。

• uaubc (2014-4-19 23:06:32)

  
  谢谢大家！我的蛋白的等电点是5.5, PH太低怕蛋白会沉淀啊

• ALALA (2014-4-19 23:06:50)

  
  1,pH调到8.
  2,方便的话buffer换成PB试一下.Tris可以和Ni相互作用.低浓度的作用很小,但应该还是有吧???
  如果his-tag被折叠到分子内部去了..那就郁闷了, 只有从上游修改了...

• uaubc (2014-4-19 23:07:11)

  提高PH到8,作用并不明显啊!20mM咪唑就全部洗了下来,还有别的方法吗?

• nn255 (2014-4-19 23:07:34)

  
  你的蛋白测序通过了吗，是不是his丢失了啊？
  如果测序正确，建议更换载体，例如把his-tag从N端换到C端。
  正常情况下，应该不会这样的，建议首先测序。