【求助】纯化蛋白???

最新回复

• abc816 (2014-4-21 11:23:53)

  
  你首先要考虑怎么得到可容蛋白吧，难道是想纯化包涵体吗
  第一复性，第二更换载体试试，第三，低温试试。

• tuuu2 (2014-4-21 11:24:19)

  
  4个Ni预柱很难做到80mg蛋白,我觉得至少也需要10毫升左右的填料,纯化的方法只能过镍柱,没更好的方法.

• eve_49 (2014-4-21 11:24:41)

  
  80mg挺多的如果柱子小得话，纯化很费时费事的，你表达的蛋白主要在包涵体里，那不妨采用纯化包涵体的方法，比如细菌裂解液裂解后超声，在尿素中溶解后，复性、浓缩，可以选用柱层析的方法纯化，具体哪种柱层析根据你们的情况选择吧。

• H2O (2014-4-21 11:25:30)

  我想问一下用凝胶过滤法进行纯化蛋白时，缓冲液根据什么配制呀？我看资料怎么用的缓冲液都不一样呀，一般用什么较好？我的包涵体是用８mol／l的尿素溶解的．

• tianmei001 (2014-4-21 11:26:00)

  请问各位师兄, 师姐!
  我最近做原核表达,蛋白以包涵体的形式出现,想纯化出80mg左右的蛋白,什么方法纯化较好?实验室有4个Ni预柱,很小,不知道能不能纯化出80mg蛋白?大概需要多久?
  
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  80mg对于实验室规模来说是比较多的了，一般好的Ni柱一毫升满载量在5~10mg,通常都很难达到这个载量，所以你至少需要10毫升介质多次纯化。如果你是需要有活性的蛋白，那就必须摸索包涵体复性了，复性能做到50%的回收率是非常好的了，换载体也是比较好的建议，但需要一次都做些不同类载体，来确定哪个载体可以可溶性表达

• tianmei001 (2014-4-21 11:26:31)

  QUOTE:

  原帖由 H2O 于 2014-4-21 11:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  我想问一下用凝胶过滤法进行纯化蛋白时，缓冲液根据什么配制呀？我看资料怎么用的缓冲液都不一样呀，一般用什么较好？我的包涵体是用８mol／l的尿素溶解的． ...

  凝胶过滤法纯化通常都是在经过初步纯化以后的步骤，这时你的目的蛋白至少要占总蛋白的50%左右吧，缓冲液没有明显限制，只要能使目的蛋白稳定就可以了，但缓冲液通常含15%NaCl，降低层析介质的非特异性吸附的问题。如果你是在8M脲缓冲液进行分子筛，这时候你要考虑温度，以及柱压得问题，因为温度低，尿素会结晶，堵塞柱子，另一方面含尿素的溶液黏度会比较大，柱压比较高。如果是溶解在尿素里的包涵体进行纯化，我倒是建议可以采用离子交换，装柱容易，速度快，操作也简单，可能会比分子筛更好

• BOSS2011 (2014-4-21 11:26:51)

  
  可以用柱层析Buffer(1L,PH 8.0):20 mM Tris--2.426 g;150 mM NaCl--8.766 g,高压灭菌，用时加PMSF.或者用PBS也可以，PH 7.4,用时也要加PMSF。

• bluelake (2014-4-21 11:27:16)

  
  谢谢各位的建议,
  就象楼上 老师说的一样,我的蛋白复性率不高,透析时有很多蛋白沉淀,这样的话就太难得到我所要的量了.

• zhenxin (2014-4-21 11:27:49)

  直接先用镍柱纯化,并且做柱上复性应该是最好的选择,别的方法都更难操作,而且效果未必好,变性条件下,镍柱的载量大概在2-5毫克/毫升填料,所以你应该要装个大点的柱子,只有4毫升比较难做