【求助】蛋白质不能用硫酸铵沉淀

最新回复

• ritou1985 (2014-4-21 15:28:37)

  
  硫酸铵沉淀只是用来初步的分离，如果光光测酶活的话也没必要沉淀啊。如果你是要分离的话肯定是要好好拿个方案来做了，离子交换，分子筛什么的还是要做做，看有什么结果。不过做分离纯化如果没有什么好的测活体系的话，这个事情不是很好办。

• okhaha (2014-4-21 15:28:58)

  
  离子交换，分子筛这些过的量少啊。还只是第一步分离，量少怕酶太少了啊

• okhaha (2014-4-21 15:29:28)

  
  30％硫酸铵沉淀下来大约10％的酶，50％的沉淀下来大约20％的酶，70％的沉淀下来大约38％的酶。

• xue258 (2014-4-21 15:29:45)

  
  我觉得在一个酶的纯化过程中衡量某一步操作是否有意义，两个参数是最重要的：比活提高（纯化倍数）和酶活收率，一步纯化后比活力如果没有提高（当然这种提高也是区别对待的，一般capture的过程比活提高并不大，以酶活收率为重，而精制时比活提高需要明显），那就没有什么意义了。另外就是酶活收率，如果酶活收率太低，那比活提高得再多也没有太大的意义。如何确定酶的纯化需要几步，其实就是在两者间找一个平衡点。
  楼主的硫酸铵沉淀处于capture的过程，70%有38%的酶活收率，我感觉还是不错的。就看这38%的比活提高情况了。如果比活比粗酶液有一定的提高就可以接受。

• wood533 (2014-4-21 15:30:04)

  
  才70%啊，为什么不继续上向摸索呢，或用两步硫酸铵沉淀呢？我的一个酶，是第一步采取了65%硫酸铵沉淀，第二步采取85%硫酸铵沉淀，最终的得率为70%。
  而且如果你硫酸铵沉淀前酶液的获得是发酵破碎细胞得来的，可以在作硫酸铵沉淀前将得到的菌体浓缩，例如200ml发酵也得到的菌体，用20mlbuffer复溶破胞的到酶液，这样做对于浓度小的酶液的硫酸铵沉淀得率相对会高一些

• guagua (2014-4-21 15:31:22)

  如果你的纯化是用测酶活来跟踪的话，比较昂贵，你可以用跑电泳的方式跟踪纯化结果，比较快而且不贵。

• 831226 (2014-4-21 15:31:50)

  30％硫酸铵沉淀下来大约10％的酶，50％的沉淀下来大约20％的酶，70％的沉淀下来大约38％的酶。
  
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  我感觉楼主的酶可能是存在多种活性形式， 这些存在形式的聚集方式不一样，疏水性肯定也不一样，沉淀时所需的硫酸铵浓度也就出现了差别，建议楼主把这三段沉淀下来的酶复溶以后分别测浓度和活性，确定比活大小，然后盯着比活最高的那部分沉淀来做。
  这样回收率肯定不高，做性质研究可以；如果做大量制备试验的话就有些不划算了，那时还是采用其他方式进行纯化。
  
  三段沉淀的酶浓度也比较低啊，我是像把上清的沉淀下来。用硫酸铵沉淀来除杂蛋白
  
  [ 本帖最后由 831226 于 2014-4-21 15:33 编辑 ]

• 831226 (2014-4-21 15:33:32)

  QUOTE:

  原帖由 wood533 于 2014-4-21 15:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  才70%啊，为什么不继续上向摸索呢，或用两步硫酸铵沉淀呢？我的一个酶，是第一步采取了65%硫酸铵沉淀，第二步采取85%硫酸铵沉淀，最终的得率为70%。
  而且如果你硫酸铵沉淀前酶液的获得是发酵破碎细胞得来的，可以在作硫酸铵沉淀前 ...

  我用100％硫酸铵沉了，也没沉下多少。而且我的蛋白是胞外的，不用破壁

• 8princess8 (2014-4-21 15:34:16)

  
  1.你沉淀时硫酸铵沉淀结合等电点了吗？可以结合等电点，调整一下PH适一下，若在不同PH下有多种酶活形式，可以分段调节PH沉淀一下试试。
  2.酶浓度是否太低，可以先浓缩一下。蛋白浓度越低沉淀所需的硫酸铵浓度越高。当然此时产生的共沉淀也会多一点。可以参考的方法见（需分子量大于10000）：
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=9393652&sty=1&tpg=2&age=0')
  当然此方法损耗会大一点，如果你有足够的样品来源的话。