【求助】怎样能使纯化的目的蛋白更纯一点呢？

最新回复

• tie8 (2014-4-25 16:47:02)

  
  多一步纯化就可以了，过完NI柱之后，通常都要进行一步分子筛继续纯化，因为有时蛋白存在不同的聚合状态，也可以分开，另外可以进一步纯化，也能将buffer通过分子筛变成你想要的buffer。

• leifengta (2014-4-25 16:47:23)

  
  最好是优化纯化条件,选择不同浓度的咪唑做阶段洗脱,找到合适浓度洗杂蛋白和目标蛋白,还需要注意样品处理,别降解或短裂那就难分离.

• yapuyapu (2014-4-25 16:47:44)

  
  感谢两位的解答。我的纯化是用酸梯度洗脱的。说明书上说包涵体用酸梯度，可溶性蛋白用咪唑梯度，可是，又不是严格限定的。不知道yunerwenyu 说的分子筛指的使用什么再纯化一遍，嘻嘻，不好意思。

• pou (2014-4-25 16:48:05)

  
  用WB来鉴定纯度？还是只跑PAGE。如是比目的条带大的带，可以考虑改变wash buffer 的条件，如果是比目的条带小的带多，要考虑是否降解。那么在处理纯化前的样品时，要注意低温和蛋白酶抑制剂的使用。

• greenbee (2014-4-25 16:48:26)

  不是所有的带HIS标签蛋白都适合用降低pH洗脱,即使是包涵体纯化也常用变性溶液加不同浓度的咪唑去洗脱,因为有时候降低pH洗脱根本洗脱不完全,目标蛋白还在柱子上,这样难有好的效果,那个用酸洗蛋白的例子很容易误导.
  变性条件下别的纯化方法都不好,所以最好别变方案,否则可能白浪费时间.

• yapuyapu (2014-4-25 16:48:47)

  我还没做WB,光跑了一下PAGE看一下，就很多杂带，主要是比目的蛋白大的条带，小的很少，PAGE结果洗脱液里蛋白很少，目的蛋白和别的蛋白没有什么差别，看来，wash buffer的条件就是不很好。可是，怎么优化呢，不知道方向呢，PH6.3,不知道改动什么方面？

• yapuyapu (2014-4-25 16:49:07)

  说的也很有道理，你说的：“即使是包涵体纯化也常用变性溶液加不同浓度的咪唑去洗脱”，意思是用我现在配置的不同酸梯度的：8M尿素，NaH2PO3,Tris-BAse等再加不同浓度的咪唑吗？洗涤液和洗脱液浓度差多少合适呢？说明书上用20mM,250mM.

• ladyhuahua (2014-4-25 16:49:27)

  
  8M尿素溶于缓冲液再加不同浓度的咪唑调pH和平衡缓冲液一致去做就可以,不同填料,不同的样品咪唑浓度洗杂蛋白和目标蛋白浓度不同,经验50mM左右洗杂带,300-500mM洗目标蛋白.

• tewank (2014-4-25 16:49:50)

  
  我也楼主有一样的问题。
  那么想请问：缓冲液的pH如何调呢？朝哪个方向调合适？
  另外，还有一个重组蛋白，纯化后蛋白极少。几乎电泳不可见。其实它只有340a'a，且确定多为可溶蛋白。只是在两端都加了his－tag。是表达量少的原因吗？为什么表达量会少呢？

• u76mp (2014-4-25 16:50:12)

  
  我觉得还是你纯化有问题, 用镍柱纯化一般蛋白纯度都在80%以上. 你主要是改变你的纯化缓冲液的PH, 可以考虑8.0, 同时提高盐浓度, 减少非特异性结合, 用低浓度的咪唑长时间洗涤.

• u76mp (2014-4-25 16:50:44)

  
  提高表达量的方法很多,需要一个一个的去try, 现在还没有一个很好的预测的方法.Merk 的自由诱导培养基可以试试. 其他需要知道你具体情况, 才能进一步优化.