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【求助】请教原核表达

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-26 21:16    作者: finger    来源: 分析测试百科网

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【求助】请教原核表达
一直在做原核,死活诱导不出带.我用的是PET-30A的载体,BL21菌株,KPNI和BAMHI双酶切的,插入片段1800左右,编码区有1400,测序结果正确,也没有移码,可是怎么都诱导不出来.....也尝试过不同IPTG浓度,和温度还是不表达,,不知道怎么办了,,请教高手帮帮忙把...Sad
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【求助】请教原核表达

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  • 小游abc (2014-4-26 21:18:11)

    这种问题在做表达的时候会经常遇到,如果所有的条件都试过了,就只能换换表达用的菌株试试,比如BL21(PLYS)对表达一些毒性蛋白可能更有利,Rosetta对表达稀有密码子含量较高的有利.另外,在表达初,最好选择更多的载体一起来构建,往往换个载体就可能有表达了!!祝实验顺利!

  • mybioon (2014-4-26 21:18:30)


    It is common that protein is not expressed in pet vectors.
    The reasons may be:
    1, rare codes exist in your protein coding sequences. (change BL21 into rosetta )
    2, promotor donnot work for your protein. (change your vecors, such as :pet28a,PGX,etc)
    3, OD is most import, you must try different OD:0.6, 1.0,etc.

  • mybioon (2014-4-26 21:23:07)

  • finger (2014-4-26 21:25:03)


    实验室一切做的他们有些一诱导就出来了，我这个就怎么都不出。谢谢！我在看看把。。。

  • @花开花落@ (2014-4-26 21:26:52)


    还有一个，温度，诱导的温度有什么特别的要求没有？有些蛋白要求低温表达，16度或者20度。你的是否有这方面的要求啊？

  • wawa (2014-4-26 21:30:34)

    QUOTE:

    原帖由 @花开花落@ 于 2014-4-26 21:26 发表

    还有一个，温度，诱导的温度有什么特别的要求没有？有些蛋白要求低温表达，16度或者20度。你的是否有这方面的要求啊？
    我感觉温度只会影响目的蛋白的表达形式和表达量的高低，并不会影响到蛋白是否表达的。一般的在初次表达时都是放到37度，诱导3个小时，然后拿菌体总蛋白跑电泳，由此来看蛋白的表达水平。
    至于降低表达温度，大部分是为了增大可溶性表达的比例。温度越低，细胞生长的越慢，可溶性表达的比例也越大，把温度放到20度左右可能会使可溶性表达的比例达到最大化，但是随之要增长诱导的时间，一般的想增加蛋白的可溶性表达，温度在30度左右即可。

  • ending (2014-4-26 21:31:33)


    从一开始做原核就是跑完后泳道都连在一起，根本分不开５５５～～～～不知道为什么？今天又是这样．．．．．跑的是菌液，沉淀重悬，煮沸１０分钟，取上清跑的．．做的都要没有信心拉！

  • finger (2014-4-26 21:32:04)

    从一开始做原核就是跑完后泳道都连在一起，根本分不开５５５～～～～不知道为什么？今天又是这样．．．．．跑的是菌液，沉淀重悬，煮沸１０分钟，取上清跑的．．做的都要没有信心拉！！

  • 莲花白 (2014-4-26 21:36:50)

    别灰心了。。
    我们实验室一个蛋白也是做了很长时间也没有表达出来，什么方法也试了，真核表达也做过。。现在没有表达出来，硬着头皮还是得做啊。。
    换载体也许很重要。。当普通的表达不成功时，融和表达也许会有用。
    我这次就打算换到pET32a载体上，试下融和表达。
    你比我幸运，你的基因测序还能测出来。我的基因因为GC值过高，测序都测不出来，已经试了很多家测序公司了。我用来表达的质粒还是老板以前从国外带回来的质粒。这个蛋白也够变态，N端一连串的都是脯氨酸和谷氨酰胺。。

  • 莲花白 (2014-4-26 21:38:31)

    问下，
    诱导时的OD值真的有必要设立梯度吗？我从来都是0.6时诱导，没有试过别的OD值。

  • finger (2014-4-26 21:38:51)

    我的ＯＤ也没设过梯度呢，都是晚上先活化，第二天早转接，摇３小时加ＩＰＴＧ诱导３小时．．然后电泳．．
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