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【求助】14kD的蛋白做Western，请关注！

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-4-26 22:09    作者: summerxx    来源: 分析测试百科网

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【求助】14kD的蛋白做Western，请关注！

我用BIO-RAD的装置电泳，湿转。电泳时12％SDS-page,浓缩胶90V,分离胶160V;转膜时先甲醇浸泡PVDF膜30秒，用0.22um孔径的PVDF膜，100V电压50min。多次无结果。内参能出来。
看了论坛里的帖子仍有疑问。
请问我的电泳和转膜过程对么？是否要用15％分离胶。转膜时间和电压（或电流）对么？
其它还要注意什么？请各位高手不吝赐教！
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最新回复

  • glass (2014-4-26 22:11:59)


    根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,你的胶浓度是可以的。
    小分子量的采用半干法转移比较好。
    内参用的是什么？分子量多大？
    湿转不是很清楚应该用具体的条件，但如果半干法：恒流　2.5mA/cm*cm 30分钟足够。
    转完之后用丽春红染膜，看看转膜效率。
    也有可能是你的一抗有问题，增加一抗浓度再试试。

  • summerxx (2014-4-26 22:12:17)


    您好,内参beta-actin,43kD,湿转100V1小时.谢谢

  • bangqi_k (2014-4-26 22:13:11)


    我用70-80V转1个小时到75分钟左右效果不错

  • BUK (2014-4-26 22:13:34)

    不知你的分子量是多少,我的52KD,胶是12.5%,浓缩胶80V,40分钟,分离胶110V,60分钟,湿转,PVDF膜先用无水甲醇泡2分钟,再用电转液泡10分钟,滤纸和胶都用电转液泡10分钟,然后电转,电转电压是35V,时间为90分钟!

  • baidukk (2014-4-26 22:14:07)


    最近3个月我就做14kd的蛋白，一般用的是15％分离胶。

  • summerxx (2014-4-26 22:15:30)

    我的是趋化因子，请问楼上您做的怎样？最近有人说我的蛋白是分泌型的，可能分泌到支气管腔中了，肯定做不出来。我看国外文献有用ELISA法做，为什么不能用WESTERN?

  • bring (2014-4-26 22:16:32)


    电转时间太长了，100V 20min 足够。而且采用0.22um 模
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