【求助】如何优化原核表达重组蛋白的条件

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• pencil菲 (2014-4-26 22:22:26)

  
  1.对于带普通T7 启动子的质粒，终浓度为0.4mM 的IPTG 可以实现完全诱导，而带有T7lac启动子的载体则需要终浓度为1mM 的IPTG 才能完全诱导。
  2.一般的诱导3小时左右就可以收集菌体，如果时间过长可能会使菌体发生自溶，产量减少。
  3.在OD600为0.4-1时都可诱导，最优的OD600为0.6
  4.一般的诱导温度都在30度到37度之间，温度越低，可溶性表达的比例越高，有时为了使可溶性表达达到最大化，甚至在15-20度内诱导，这时菌体生长慢，诱导时间肯定要变长，最长可以过夜诱导。
  这四个条件中IPTG浓度和诱导时细胞浓度都是很好确定的，诱导时间和温度要根据目的蛋白想要得到的表达形式来自己摸索。

• join (2014-4-26 22:23:43)

  谢谢您的帮助，
  我还想问具体点，第一步，优化诱导的IPTG浓度，先把诱导时间定为5h，开始诱导时OD600的细胞浓度定为0.4，诱导温度定为37度，然后把诱导的IPTG浓度分为0.1mM ，0.5mM ，1.0mM 三组，如下
  △Cell density △Induction temperature △Induction time △IPTG concentration
  OD600=0.4 37℃ 5h 0.1mM
  OD600=0.4 37℃ 5h 0.5mM
  OD600=0.4 37℃ 5h 1mM
  看5小时后SDS-PAGE的电泳情况，哪个诱导的产量大，就可以定下那个IPTG浓度为最优。
  下一步，就可以优化诱导时OD600的细胞浓度，优化后的IPTG浓度，把诱导时间定为5h，诱导温度定为37度，然后把诱导时OD600的细胞浓度分为0.2，0.4，0.6，0.8 四组。
  接下来在优化诱导时间和诱导温度。
  请帮忙，我这样做的顺序对不对？

• hold住 (2014-4-26 22:24:14)

  
  我感觉诱导时IPTG浓度和OD不用优化，这些都是程序化的东西，已经被novagen这些大公司研究的很清楚了，很少有例外的。如果你是在做论文，可以按照上面的步骤做，以丰富内容，否则直接按照现有的资料做就可以，没有必要去优化！

• yayya (2014-4-26 22:24:32)

  
  以前的链接，希望对你有点用
  cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/8738988')

• idea2011 (2014-4-26 22:25:56)

  我感觉诱导时IPTG浓度和OD不用优化，这些都是程序化的东西，已经被novagen这些大公司研究的很清楚了，很少有例外的。如果你是在做论文，可以按照上面的步骤做，以丰富内容，否则直接按照现有的资料做就可以，没有必要去优化！
  
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  Different ODs should be tried.
  Some proteins that I worked on didnot express when OD was over 0.5.
  Different ODs often really makes different production.

• pencil菲 (2014-4-26 22:26:47)

  我做的几个蛋白直接就是按照0.6左右就诱导了，老师催得紧，表达出来以后就开始分离纯化了，根本就没有优化，我看novagen公司的表达手册上写的，只要在0.4-1之内诱导就行。
  如果进一步优化的话，可能效果会更好。