新型脲酶试剂的研制和应用

固体脲酶的制备方法目前仍采用传统的盐析法。此法包括溶剂提取、膜透析、盐析、多次重结晶、离心沉降、有机溶剂沉淀等步骤,制备过程极为繁杂。本文报道的制备稳定脲酶液的新工艺只需溶剂提取一个步骤,我们称为一步法制备脲酶。吸附脲酶的制备只经溶剂提取和超滤浓缩两个步骤,我们称为二步法制备脲酶。这将为脲酶试剂的制备开辟一个新的途径。

由于传统盐析法操作手续繁复,脲酶损失和失活的机会多,1kg刀豆只能制备固体纯酶0.25g。我们采用二步法,1kg刀豆可制出200g吸附脲酶,约含纯脲酶20g,产率是盐析法的80倍。

现市场上的固体脲酶在2~8℃下冷藏,只能存放1年;脲酶溶液的半衰期只有7天。我们研制的吸附脲酶在常温下干燥器内存放6年,其活性无下降趋势;稳定脲酶液在2~8℃下密封保存3年,其活性基本保持不变。这在脲酶产品稳定性方面是一个很大的突破。

另外,我们在吸附脲酶的基础上又研制出尿素试纸和复合纤维素固定化脲酶。

1 实验部分

1.1 主要仪器和材料

SS-3型钟罩式超滤器(上海兴华电子仪器厂);DBG台式恒温干燥箱(重庆试验设备厂);TG328A型分析天平(上海天平仪器厂)。

洋刀豆(广州白云山)。

1.2 实验方法

1.2.1 稳定脲酶液的制备

将洋刀豆浸泡剥皮后研磨成浆,用缓冲溶液提取,在提取液中加复合稳定剂。复合稳定剂
由防腐剂、防沉剂、激活剂和固定剂组成。

1.2.2 纤维素——醋酸纤维素(CAC)增强超滤膜的制备

将洋刀豆浸泡剥皮后研磨成浆,用缓冲溶液提取,在提取液中加复合稳定剂。复合稳定剂由防腐剂、防沉剂、激活剂和固定剂组成。

1.2.2 纤维素——醋酸纤维素(CAC)增强超滤膜的制备

参考文献[3]进行。

1.2.3 吸附脲酶的制备

平板膜静压过滤,用钢瓶压缩氮气加压。选择对脲酶有亲和性的纤维素材料为载体,把适当厚度的载体铺在CAC超滤膜面上,将待浓缩的稳定脲酶液注入滤器中,加压过滤。当载体表面脲酶液浓缩到不具流动性时,把湿的吸附脲酶取出置于干燥器内阴干。

1.2.4 复合纤维素(CC)固定化脲酶的制备

在一片吸附脲酶上滴加2.5%的戊二醛,滴加剂量以浸透吸附脲酶但又不会有液体滴下为宜。在干燥器内阴干,制成交联固定脲酶。以6%~10%醋酸纤维素为膜材料,丙酮为溶剂,混以其他添加剂,制成包埋膜液。用细线系住一小片交联固定脲酶,浸到膜液中,取出后在水中凝胶成膜。凝胶后从水中取出,置于干燥器内阴干,制成CC固定化脲酶。文中简称CC固酶或固酶。

1.2.5 尿素试纸的制备和使用

把吸附脲酶裁成8mm×60mm的小条,在其上滴加1%酚酞指示剂,滴至润湿为止,在干燥器内阴干,制成尿素试纸。把被测固样配成3%的水溶液,在尿素试纸上滴一滴被测液,液滴由无色慢慢变为粉红色,一般需20s以上才能显色。若其他碱性液滴在该试纸上,会立即出现紫红色。中性及酸性液滴在其上不显色。于是可判定被测物质是否是尿素。

1.2.6 稳定脲酶液和吸附脲酶的活性定义和活性测定

参考企业产品标准[6,7]进行。

1.2.7 产品储存

稳定脲酶液在2~8℃下密封保存。吸附脲酶、CC固酶和尿素试纸在室温下干燥器内保存。

1.2.8 酶法分析尿素

按GB3598-83的方法操作。通常100m尿素需加5mL稳定脲酶液或200mg吸附脲酶。

2 结果与讨论

2.1 复合稳定剂中各组分的作用

用于尿素分析的脲酶无需精制,可直接使用其提取液。但脲酶分子结构复杂而脆弱,对环境因素极为敏感,存放寿命很短,据文献报道,脲酶溶液在4℃下冷藏,半衰期只有7天。要把脲酶提取液作为商品性分析试剂,必须建立一个稳定体系来维持脲酶的分子结构和活性部位,以便延长其保存寿命。为此,我们研制出一种由复合添加剂组成的稳定体系,从而大幅度提高了液体脲酶的稳定性。

2.1.1 缓冲剂的作用

脲酶分子上的极性基团能与水中的氢离子和氢氧根离子形成氢键。当水中H+或OH-浓度增大时,会使某些部位的氢键加强,引起酶分子变形,酶活性部位受到影响或遭到破坏,脲酶活性降低甚至消失。为了维系脲酶分子的构象,脲酶液体系必须维持在一定的pH范围内。在我们的实验条件下,最佳pH范围为6.0~6.5(表1)。因此,我们采用pH6.5的缓冲液为提取液,当其他添加剂都加到体系内后,pH刚好维持在6.0~6.5范围内。

1.GIF

2.1.2 防腐剂的作用

脲酶是从刀豆粉中提取出来的,提取液中含有滋生微生物的营养物质,为使产品不发霉变质,我们在脲酶提取液中加了少量防腐剂。

2.1.3 防沉剂的作用

稳定脲酶液放置时间太久会出现沉淀,但脲酶活性不会降低,使用时摇匀即可。为了使产品给人以清洁透明的观感,可在溶剂系统中加少量防沉剂。

2.1.4 激活剂的作用

脲酶在提取过程中受到光照、加热、原料中杂质及水中重金属的影响,其活性有明显下降迹象,加入一定量的激活剂,脲酶的活性和稳定性均得到大幅度提高。

2.1.5 固定剂的作用

在脲酶液中加一种可溶性线性高聚物,使其在溶剂系统中构成栅网状,对脲酶分子起固定作用,从而维系住脲酶分子的构象,达到提高脲酶稳定性的目的。

2.1.6 复合添加剂的综合效应

我们将上述各添加剂按比例混合,加在一脲酶试液中进行观测,取得理想的结果。脲酶液冷藏半衰期达到2年以上(表2),室温保存半衰期达9个月以上(表3)。按照企业标准包装的全密封稳定脲酶液冷藏3年后,其活性下降极微,经常开盖检测的中试产品半衰期也达到2年以上(表4),超过企业标准规定的指标。

2.GIF

3.GIF

4.GIF

2.2 CAC膜浓缩脲酶的浓差极化现象

当脲酶液由静压推动到膜表面时,水和其他小于膜孔的粒子及分子量为5万的刀豆球蛋白透过膜,分子量为50万的脲酶被膜阻止,并且聚集在膜表面形成阻隔层。此处的酶活性最大,是滤器内本体溶液酶活性的5倍以上,这些脲酶被载体吸附后制成高活性的吸附脲酶。

2.3 影响膜分离效果的几个主要因素

2.3.1 膜孔径的影响

按照筛分机理,膜孔径越大,渗透性越好,截留率越低。在实际应用中,要选取那些对被浓缩物质的截留率达90%以上、孔径尽可能大的分离膜。

[ 本帖最后由 fjdlgldg 于 2010-9-2 16:36 编辑 ]