耐热大肠菌群——多管发酵法

关键词：国家二级标准物质  标准样品研究所  对照品查询  分析纯试剂AR
    1．引导问题
    粪便污染指示菌是微生物方面质量验证的重要参数，粪便污染指示菌应当符合一定的标准．其结果才有意义。这些指示菌应该普遍大量存在于人类和其他温血动物的粪便中，用简单的方法就能检测，而且它们不能在天然水中生长繁殖。
    由于某些水质条件下．大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，尤其是在有生物膜存在的情况下更易生长繁殖．这是大肠菌群作为指示菌的不利之处。
    我国习惯将耐热大肠菌群(thermotolerant coliform)称为“粪大肠菌群”，事实上，耐热大肠菌群中许多种类并非粪便来源。通常情况下耐热大肠菌群与总大肠菌群相比，在人和动物粪便中听占的比例较大．而且由于在自然界容易死亡等原因。耐热大肠菌群的存在可认为近期水体直接或间接地受到了粪便污染。因而，与总大肠菌群相比，耐热大肠菌群在水体中的检出，说明水体更为不清洁、存在肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大，比总大肠菌群更能准确地反映水体受人和动物粪便污染的程度，在水处理各个工艺中担任着重要的指示粪源菌去除效率的作用，也用于评估不同质量的水所必须处理的程度以及细菌去除率目标的确定。且其检测方法比埃希大肠杆菌简单得多，用来作为粪便污染指示菌更有利。WHO也指出，对农村供水来说，总大肠菌群不能作为粪便污染指示物，特别是在热带地区，很多没有卫生学意义的细菌都可出现在供水中，所以必须有其它更准确的粪便污染指示物。同时耐热大肠菌群也不太可能在配水系统中再繁殖，除非管网中有充足的营养物质(BOD5)超过10mg／L或者不合适的物质接触到处理后的水，水温超过15℃，管网中没有游离余氯。
    2．方案描述
    用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在(44．5±0．5)℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。
    耐热大肠菌群滤膜法是指用孔径为0．45μm的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，(44．5±0．5)℃培养(24±2)h能形成特征性菌落，以此来检测水中耐热大肠菌群的方法。
    3．方案实施
    (1)培养基
    ①EC培养基  成分：胰蛋白胨(20g)；乳糖(5g)；胆盐三号(1.5g)；磷酸氢二钾(4g)；磷酸二氢钾(1.5g)；氯化钠(5g)；蒸馏水(1000mL)。
    制法：将上述成分加热溶解，然后分装于带有倒管的试管中，置高压蒸汽灭菌器中，68．95kPa(115℃，10 lb)灭菌20min，最终pH应为6．9±0．2。
    ②伊红亚甲蓝培养基(EMB培养基)：同总大肠菌群中的培养基。
    (2)仪器
    恒温水浴[(44．5±0．5)℃]或隔水式恒温培养箱；冰箱0～4℃；天平；显微镜；平皿(直径为9cm)；试管；分度吸管，1mL、10mL；锥形瓶；小倒管；载玻片。
    (3)检验
    将水样充分混匀后，根据水样污染程度确定水样接种量，每个样品至少用三个不同的水样量接种，同一接种水样量要有五管。
    相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0．1mL，受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0．1mL、0．01mL或0．1mL、0．01mL、0．001mL。
    自总大肠菌群乳糖发酵试验管中的阳性管(产酸产气)中取l滴转种于EC培养基中，置(44．5±0．5)℃水浴箱或隔水式恒温培养箱内(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面)培养(24±2)h，如所有管均不产气，则可报告为耐热大肠菌群阴性，如有产气者，则转种于伊红亚甲蓝琼脂平板上，置(44．5±0．5)℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。
    如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群接种于乳糖蛋白胨培养液(44．5±0．5)℃下水浴培养．以下步骤同上。
    (4)结果报告
    根据证实为耐热大肠菌群阳性管数，查最可能数(MPN)检索表，报告每l00mL水样中耐热大肠菌群的最可能数(MPN)值。
    4．能力要求
    能够描述耐热大肠菌群检测任务来源、检验方案，会配制EC培养基和MFC培养基，学会多管发酵法和滤膜法测定耐热大肠菌群。