【求助】咪唑浓度

最新回复

• wood533 (2014-5-06 16:57:59)

  
  一般来说是通过梯度洗脱，20mM、50mM、100mM、250mM，这四个梯度就够了，通常都是在250mM的时候就洗脱出来了。
  你可以取样跑胶分析，我怀疑你的蛋白是不是根本没有挂柱啊，不过有一点肯定，500mM用来洗脱蛋白绝对够了。

• wmp1234 (2014-5-06 16:58:24)

  
  请先确定是否成功挂柱，然后可以适当降低缓冲液pH，减弱亲和作用。500mM已经不小了，一般应该能洗下来了，咪唑也不便宜啊。
  还有就是加点triton，tween，NaCl，BME什么的，别形成聚合体。

• douding66 (2014-5-06 16:58:45)

  
  我已经取样分析了 ，看流穿液与样品比较 ，目的蛋白明显减少，证明是挂住了，而且蛋白被NaOH洗脱下来，曾怀疑是上样量太大引起蛋白浓度过高在柱内沉淀，但是减小蛋白量后，还是没有效果。究竟什么原因啊

• 逗号是句号 (2014-5-06 16:59:02)

  
  静态吸附，装柱，洗脱试一下。以前做过一个木聚糖酶的Ni柱纯化，样品一上柱就有沉淀，采用静态媳妇以后可以有效的避免局部蛋白浓度过大产生的沉淀，不妨一试。

• 小糖块 (2014-5-06 16:59:21)

  
  建议你把ni柱用NaOH处理，然后用梯度乙醇洗脱，具体步骤可参见Ni柱说明书。
  我怀疑是Ni柱上挂了许多疏水性杂质（膜脂等）阻止了咪唑洗脱。
  你的盐浓度是多少啊，最好也要大于300mM

• moonlight45 (2014-5-06 16:59:39)

  
  什么是静态吸附?

• wmp1234 (2014-5-06 17:00:05)

  
  调整缓冲液和样品的pH,应该是不合适导致沉淀,也可以在里面加0.5%吐温或triton,这样可以避免沉淀.

• ukonptp (2014-5-06 17:00:36)

  静态吸附就是把蛋白样品和凝胶，及缓冲液按一定比例放置一封闭体系中（如三角瓶中），摇床上低温慢速摇，时间可以放长一点，4个小时以上吧。可以定时测定溶液中的目的蛋白，以判断有多少蛋白被吸附。吸附结束后，把凝胶装柱，洗脱。这么做的好处是可以减少蛋白发生沉淀的可能，而且凝胶吸附量较大。缺点是浪费样品：）

• remenb (2014-5-06 17:01:07)

  
  同意楼上，我用静态吸附，效果不错

• remenb (2014-5-06 17:01:30)

  
  是不是你的蛋白折叠的过程中有错误，导致His tag没有露出来。可以在样品中加盐酸胍，使蛋白去折叠，过完柱子后然后透析复姓，仅供参考啊！

• 6327555 (2014-5-06 17:01:55)

  
  梯度洗脱是怎么？不上仪器就靠重力洗脱收集的话也可以梯度洗脱么？
  是在洗脱液里面加吐温-20么?作用是什么？