【求助】western-blot疑难

最新回复

• 2541 (2014-5-06 17:22:41)

  
  1“蛋白目的条带在100kd,在１０％SDS-PAGE上条带清晰" 说明你的目的蛋白表达了，应该不是表达方面的问题。
  2我感觉商品化的酶标二抗如果是从正规厂家购买的话，应该也没问题，不过要注意稀释倍数。
  那最后只能怀疑的你的单抗了，是不是你单抗针对的表位不是你的目的蛋白的表位？

• bamboo16 (2014-5-06 17:23:03)

  
  1.你的蛋白在煮前加了DTT没有？因为单抗识别的往往是几个氨基酸序列，如果空间结构没有充分暴露的话，显色常一片空白！
  2.如果加完发光剂后没有肉眼可见的荧光，并不一味着压不出条带。
  3.二抗有没有加错？抗兔，抗鼠？
  3.最后才考虑一抗问题，原装的吗？怎么保存的？

• shenkunjie (2014-5-06 17:24:14)

  
  我不知道你是用阅片机还是用显影，定影液的方法洗胶片，如果是后者的话，建议换一下显影，定影液，我以前明明可以看到发光带却曝不出来，换了显影，定影液，就座出来了。

• 爱老虎游tt (2014-5-06 17:24:39)

  
  感谢各位高手指点!
  我用的是HRP标记的二抗(中山)的.
  请问TT是什么?我煮样的时候没有加啊!
  一抗是原装的,但已经有一年了吧!上届研究生给我的,在-40度保存的.
  今天又做了,还不知道结果,但实验还要继续呀!

• eve_49 (2014-5-06 17:25:01)

  1“蛋白目的条带在100kd,在１０％SDS-PAGE上条带清晰" 说明你的目的蛋白表达了，应该不是表达方面的问题。
  如果是原核表达,那根据量的多少,可以确定是不是你要的蛋白,如果是真核表达,你就不能确定了吧.凭什么就肯定是你要的蛋白呢?真核表达跑PAGE是经常看不出来的.

• 大尾巴 (2014-5-06 17:25:29)

  QUOTE:

  原帖由 爱老虎游tt 于 2014-5-6 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  感谢各位高手指点!
  我用的是HRP标记的二抗(中山)的.
  请问TT是什么?我煮样的时候没有加啊!
  一抗是原装的,但已经有一年了吧!上届研究生给我的,在-40度保存的.
  今天又做了,还不知道结果,但实验还要继续呀! ...

  DTT是用来还原二硫键的。
  试验要越挫越勇，要镇定执着。呵呵

• ROSE李 (2014-5-06 17:27:51)

  
  DTT二硫苏糖醇，蛋白质保护剂，有时也用2-巯基乙醇。而这些都是二硫键还原剂，能把二硫键打开变为两个巯基，此时蛋白质聚体会分开，形成单体，电泳后分别对应单体分子量的marker带。

• bs4665 (2014-5-06 17:28:10)

  
  100kD的可以用8%的胶转,然后大分子转的时候在电转移液中可以加入SDS(终浓度不高于0.01%),减少甲醇的浓度至5%或者不用.

• 2541 (2014-5-06 17:28:32)

  
  请教各位,WESTERN的一抗是否必须单抗

• 131415 (2014-5-06 17:29:08)

  一抗一般是单抗,但我的WB中一抗是血清,是多抗

• 3648755 (2014-5-06 17:29:32)

  不知楼主有没有同时做内参，若内参作出了，就说明你的操作没问题。不知你一抗稀释度多少，可提高看看。

• 蒲公英 (2014-5-06 17:29:58)

  
  我做的ＩＬ－３蛋白结构中也存在两个二硫键，还有糖基．请问我需要做什麽处理才能充分显出一级结构．也需要加ＤＴＴ吗？什麽时候加？应该怎样加？我的目的蛋白表达量很少，我在操作中应注意什麽，才能看到我的目的条带？焦急等待各位高手指点，感谢万分！

• 33号 (2014-5-06 17:30:46)

  QUOTE:

  原帖由 蒲公英 于 2014-5-6 17:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我做的ＩＬ－３蛋白结构中也存在两个二硫键，还有糖基．请问我需要做什麽处理才能充分显出一级结构．也需要加ＤＴＴ吗？什麽时候加？应该怎样加？我的目的蛋白表达量很少，我在操作中应注意什麽，才能看到我的目的条带？焦急等待各位高手指点，感谢万 ...

  保证你的ddt有效呀,加上样buffer时加, 如果表达少看可不可以加大一些上样量

• 蒲公英 (2014-5-06 17:31:06)

  上样buffer是不是loading buffer?我的loading buffer是成品,不知道含否DTT?如果需要加的话,加多少呢?加完再98度变性对吗?急切盼望详细说明.多谢!

• 蒲公英 (2014-5-06 17:33:49)

  
  相关疾病：
  浆细胞白血病
  我也在做WB,遇到很多问题,我做的是白血病细胞系细胞.目的蛋白是IL-3,15KD.取3X106细胞,EP管中加入80ul细胞裂解液,加对应量PMSF.在裂解细胞时剧烈摇匀,浓缩胶5%,65V50min,分离胶100V2.5 h.转膜80V,2小时,预染marker能全部转过去.β-actin一抗是单抗,IGM的,IL-3也是单抗,IGG的.膜分开一抗孵育.DAB显色。预染蛋白MARKER分子量为75、58、38、20、13。结果β-actin一抗１：７５０（说明书上１：１０００）,二抗1:1000(1:1000-1:3000)条带在58和38之间(离58更近些)及平行于38偏低位置各有一条带，亮度也弱。而IL-3（一抗1:500,二抗1:500）在20和13之间没有条带。我把β-actin一抗1：500，二抗1：500）稀释,竟然出现四条带.在上述两条带下分别出现,但是比上两条带细,其中一条似乎是我想要的.我的裂解液是否有问题？1XPBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 补1XPBS缓冲液至 100ml。为什麽β-actin出了两条带，位置不对,亮度也不高,而1:500稀释后出现四条带,好象其中一条是我想要的.单抗怎麽会出现这种情况呢?IL-3为什麽不出结果？是否我的裂解液有问题？因为IL-3表达量很低，而且有两个二硫键，还有糖基。应该用啥样的裂解液啊？哪里需要改进？焦急等待指点。

• DDD (2014-5-06 17:34:15)

  像楼主这样大分子的蛋白有没有可能出现转膜时间过长导致转过头的现象发生呢？

• eric930 (2014-5-06 17:35:19)

  
  你转的时间太长了吧，17v，30min 就行了

• eric930 (2014-5-06 17:35:44)

  我做的ＩＬ－３蛋白结构中也存在两个二硫键，还有糖基．请问我需要做什麽处理才能充分显出一级结构．也需要加ＤＴＴ吗？什麽时候加？应该怎样加？我的目的蛋白表达量很少，我在操作中应注意什麽，才能看到我的目的条带？焦急等待各位高手指点，感谢万分！
  
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  裂解之后加，然后再煮，表达量少的话家加大上样量，延长曝光时间，祝实验成功

• plaa (2014-5-06 17:36:25)

  我也在做WB,遇到很多问题,我做的是白血病细胞系细胞.目的蛋白是IL-3,15KD.取3X106细胞,EP管中加入80ul细胞裂解液,加对应量PMSF.在裂解细胞时剧烈摇匀,浓缩胶5%,65V50min,分离胶100V2.5 h.转膜80V,2小时,预染marker能全部转过去.β-actin一抗是单抗,IGM的,IL-3也是单抗,IGG的.膜分开一抗孵育.DAB显色。预染蛋白MARKER分子量为75、58、38、20、13。结果β-actin一抗１：７５０（说明书上１：１０
  
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  13KD的Marker也转到膜上了？清晰吗？