【求助】质粒提取怪现象

最新回复

• wood533 (2014-5-07 11:01:31)

  这个是照7个样品的图片

  
  29826023.jpg

• one (2014-5-07 11:01:51)

  
  上面的琼脂糖和下面的非变性PAGE胶跑的都挺好的。
  没有做过相关实验，只是问一下：基因组DNA污染有没有可能？

• wood533 (2014-5-07 11:02:51)

  QUOTE:

  原帖由 one 于 2014-5-7 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  上面的琼脂糖和下面的非变性PAGE胶跑的都挺好的。
  没有做过相关实验，只是问一下：基因组DNA污染有没有可能？

  首先谢谢您的意见。 我才刚开始接触分子生物学，对这个不是很了解，但是我用的是碱裂解法，会不会可能有基因组DNA呢？

• moonlight45 (2014-5-07 11:03:15)

  
  可能基因组污染，酶切下看看电泳

• moonlight45 (2014-5-07 11:04:16)

  
  很可能是基因组DNA污染！

• luoliqiong (2014-5-07 11:06:56)

  
  有一个问题：质粒检测是没有必要点Marker的，点了也白点！除非你单酶切之后才能判断质粒的大小！

• kswl870 (2014-5-07 11:07:37)

  肯定是基因组.

• zranqi_1 (2014-5-07 11:08:02)

  一般跑质粒时都会出现至少两个band，一个是 super-coiled form，另一个是 relaxed circle，两者是同一质粒但不同3极解构的DNA，前者是聚集且密度高的分子所以跑得比较快，後者比较宽松且正面面积大，泳动时阻力大所以跑得比较慢。有时会出现第三个band，他跑得最慢，是断成一截的质粒。
  由上面的两个琼脂糖泳动图（不是非变性PAGE胶），跑得最快的两个bands应该是所要的质粒，而最上边的band无法判别是截断的质粒或是
  chromosome DNA。可用酶切後辨别，或是用chromosome DNA在同一胶片同时泳动，比较前後位置，应该就行了。

• wood533 (2014-5-07 11:08:28)

  可能基因组污染，酶切下看看电泳
  
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  谢谢老师的宝贵意见, 我咨询过这方面的老师,他们也建议我作一下酶切验证. 至于基因组污染那是什么原因造成的呢?

• wood533 (2014-5-07 11:08:51)

  一般跑质粒时都会出现至少两个band，一个是 super-coiled form，另一个是 relaxed circle，两者是同一质粒但不同3极解构的DNA，前者是聚集且密度高的分子所以跑得比较快，後者比较宽松且正面面积大，泳动时阻力大所以跑得比较慢。有时会出现第三个band，他跑得最慢，是断成一截的质粒。
  由上面的两个琼脂糖泳动图（不是非变性PAGE胶），跑得最快的两个bands应该是所要的质粒，而最上边的band无法判别是截断的质粒或是
  chromosome DNA。可用酶切後辨别，或是用chromosome DNA在同一胶片同时泳动，比较前後位置，应该就行了。
  ......
  
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  我在梁宋平写的<生物化学与分子生物学实验教程>中看到质粒DNA分子的三种不同构型电泳位置是这样的: 跑在最前面的那条带是SC构型,其后依次是
  LDAN和ocＤＮＡ　但是从我张图看来，跑在最后面的那条带特别亮，应该不能是开环ＤＮＡ．　所以我认为不是截断的质粒．＂用chromosome DNA在同一胶片同时泳动，比较前後位置，应该就行了。＂是不是还得用提基因组的方法提一下基因组呢？

• wood533 (2014-5-07 11:09:29)

  肯定是基因组.
  
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  可是我用的是碱裂解法，通常是出现什么问题才会提出基因组呢？整整花了我两周的时间　还没有解决．急！

• 49888 (2014-5-07 11:09:58)

  可是我用的是碱裂解法，通常是出现什么问题才会提出基因组呢？整整花了我两周的时间　还没有解决．急！
  
  ===============================================================================================================
  
  我想有一下几个原因供参考：
  1、菌体量过多，加入溶液II后裂解不充分，加入溶液III后太粘稠，颠倒混匀时机械剪切力太大，将gDNA打断，随质粒一起沉淀下来了。
  2、加入溶液I和溶液II后操作不轻柔，机械剪切力将gDNA打断，随质粒一起沉淀下来了。
  所以建议减少菌体量，加入溶液I和II后轻柔操作，轻轻上下颠倒3－4下就好了，千万不要剧烈摇动！！或者加大试剂量，注意溶液I、II、III要按比例增加！

• wood533 (2014-5-07 11:10:39)

  我想有一下几个原因供参考：
  1、菌体量过多，加入溶液II后裂解不充分，加入溶液III后太粘稠，颠倒混匀时机械剪切力太大，将gDNA打断，随质粒一起沉淀下来了。
  2、加入溶液I和溶液II后操作不轻柔，机械剪切力将gDNA打断，随质粒一起沉淀下来了。
  所以建议减少菌体量，加入溶液I和II后轻柔操作，轻轻上下颠倒3－4下就好了，千万不要剧烈摇动！！或者加大试剂量，注意溶液I、II、III要按比例增加！
  ......
  
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  感谢老师的指导：我昨天把溶液I、II、III重新都配了一下，之前的是4.5号配的。昨天晚上我重新做了质粒提取，加溶液I（100微升）时用枪头吹匀，然后放置10分钟，加溶液II（200微升）时，我轻轻上下颠倒5下，冰上放置2分钟后加溶液III（150微升） 冰上放10分钟后离心，结果还没有出来，马上就要点样了。

• wood533 (2014-5-07 11:11:24)

  
  问题已经解决了,我把溶液I、II、III重新都配了一下,再做就不出现基因组DNA了.谢谢大家的宝贵意见,我想这也可以做一些经验,给园子里的朋友借鉴一下.