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【求助】过Ni亲和柱出现奇怪现象

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-07 17:04    作者: windboy    来源: 分析测试百科网

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【求助】过Ni亲和柱出现奇怪现象

刚刚开始做蛋白的纯化，遇到的情况有些奇怪.希望大家能帮我分析分析.
我的蛋白是一种醇脱氢酶，结构分析可能是含有锌离子的。连在pET28a上在大肠杆菌中做的表达，C端含有6个His。超声破细胞后，35000g离心30min后上清过Ni亲和柱（Novagen的，前几天我师姐刚过过，是正常的）。第一次过柱过程中，上样后浅蓝色的柱填料上面渐渐出现一层白色沉淀状物质，同时柱子有点堵。洗脱后跑蛋白胶，目的条带很明显，量也满大的。于是我就做了透析，用的是20mM Tris-Cl pH8.0,加了终浓度1mM的DTT。然而，透析袋内却渐渐出现棕色絮状物质，透析不能继续进行。将透析袋内液体装入dorf管，存于-20度，过夜后，沉淀更明显了，上清已基本测不到蛋白。第二次过时，我换了新的填料，上柱情况还是这样。洗脱后，我就没有做透析，洗脱液直接存于冰箱中，无意间发现在冰上放置一段时间，澄清的溶液中也渐渐出现絮状沉淀。我问过我的师兄师姐，他们过Ni亲和柱都没有遇到过这种情况，不知大家有没有谁遇到过这样的现象？问题出在哪里呢?
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  • sunnyB (2014-5-07 17:04:53)


    你的蛋白等电点是多少呀?是不是正好在你的洗脱液的PH值那.那样的话,可能会有沉淀.你应该和你师姐的蛋白不是同一种,可以在你的蛋白上考虑考虑.

  • gemei0115 (2014-5-07 17:05:12)


    猜一个哈，可能就是胡说了。
    Ni-NTA（现在的Ni亲和基本上都是这种）可以用NiSO4溶液来挂镍，同样也可以用ZnSO4溶液挂锌（和Ni相比可能对His-tag亲和要弱一些,用的人少）这两种金属以离子形式存在即可。所以有没有可能是凝胶“夺”你蛋白中的锌离子，导致结构域被破坏，稳定性降低，呵呵。
    以上纯粹凭空想象的，没有任何事实依据，贻笑大方了

  • windboy (2014-5-07 17:05:38)

    谢谢!
    我的蛋白等电点6.38,洗脱液pH是7.9的,应该不是pH问题.
    楼上的分析满有道理的,那我是不是应该用ZnSO4溶液挂柱呢?

  • windboy (2014-5-07 17:06:00)


    还有,好象含锌离子的酶还是满多的,是不是过Ni亲和柱都会出现类似的情况?

  • xyw5 (2014-5-07 17:06:17)


    锌离子在碱性条件下容易产生白色的沉淀，上样就开始有沉淀那你洗脱后沉淀还在上面的话也许是锌离子，也许是蛋白，所以你可以在同样条件下把样品放置看是不是容易沉淀．透析后产生棕色的沉淀也许是镍离子沉淀，因为在碱性条件下镍离子也容易沉淀，一旦镍离子被DTT还原会出现棕色的沉淀，至于白色沉淀那应该是蛋白本身的沉淀．理论上镍柱如果能抓出锌离子是不会出现沉淀的，所以沉淀还是蛋白本身的可能性更大．

  • eric930 (2014-5-07 17:06:40)


    感觉1mmDTT不足与还原Ni2+，Novagen的我用过，基本上1mmDTT和10MMBME都是很保险的。我又看了看文献，IDA可以结合Zn和Ni，而且效果差不多。可以参考以下的文献，是不是NTA也是这样呢？
    所以我还是觉得可能就是Zn2+被键合，蛋白被结合于柱上，洗脱时蛋白被洗脱，但Zn2+仍然键合在柱上，导致蛋白结构受损，稳定性下降，沉淀。
    至于生成的棕色沉淀的原因我也不清楚，但是很多包涵体蛋白变性后就是颜色变深，复性后又会变浅，原因我不清楚，盼望高手指教。

  • xyw5 (2014-5-07 17:06:58)


    螯合好的镍离子相对游离的来说相对稳定,但是如果你用1mmDTT洗足够多的体积也一样被还原,何况是在溶液中的镍离子,而且外面透析缓冲液中还有大量体积的1mmDTT,所以有镍离子发黄是很正常的,蛋白变性大多还是白色的,而包含体黄那是因为不纯,并非是蛋白变性而发黄,个人意见.

  • windboy (2014-5-07 17:07:31)

    未过柱的粗酶液一直都没有沉淀出现过,它的缓冲是5mM咪唑,0.5MNaCl,20mM Tris-Cl,pH7.9.
    我做了一个小实验,在粗酶液中直接加入了50mM NiSO4,结果有白色絮状沉淀出现了.不知道这是不是说明镍会让我的蛋白失活,还是含His-Tag的蛋白跟镍就会这样?

  • eric930 (2014-5-07 17:08:06)


    如xyw5所说，那做Ni柱时1mm的DTT也不安全吗？
    分子与离子间的反应源于碰撞，1mm浓度他们碰撞的几率太小了吧？
    的确只要足够体积，一样可以发生还原反应，但是那个足够的体积恐怕和正常层析所需的缓冲液体积要相差数量级了吧？我觉得正常的层析，1mm的确安全。
    如果产生的棕色沉淀缘于一定量的脱镍，那么这种明显的脱镍的原因何在？是否可以认为是Zn2+ 与Ni2+ 发生了类似离交的现象？

  • xyw5 (2014-5-07 17:08:42)

    我怀疑是由于镍离子有部分没洗干净,所以游离出来,重金属离子是会导致蛋白变性,这也是重金属中毒的原因,通常做纯化都没这样的问题,所以重新螯合的柱子一定要洗干净.
    对镍柱而言,1mM的DTT几个柱体积是没问题,但是要上几十倍的体积那 就很难说了,而且和pH也有关系,我曾经听客户说用这样浓度的填料也变黄,所以没绝对安全的事.实验的问题可以多做几次看看,有时候偶然不一定就是必然.
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