【求助】western-blot的有关问题！

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• qhyu (2014-5-08 10:15:06)

  QUOTE:

  原帖由 lxh031 于 2014-5-8 10:14 发表
  
  我的目的蛋白定位在细胞核，那用裂解总蛋白的方法也会浓度比较低吧？摸转膜条件最初应该以什么标准开始呢？我也要开始做western-blot啦，但有很多不明白的地方，我是新手，请各位高手多多帮忙！谢谢！  ...

  开始做western-blot前来找些经验的确是明智之举！可惜我开始做时还没来丁香园，遗憾！
  给你些建议吧：
  1、首先是蛋白裂解，核蛋白有专用的裂解液，园子里很多，建议学会搜索。
  2、学会参考，首先在文献及别人的资料中找有用信息，如别人用的总蛋白量，蛋白丰度，作WB的各种条件，蛋白特性及注意条件。
  3、转膜等条件根据分子量调整，不过影响不是很大，可按试验实传统方法做，看结果在作调整。
  4、新手么，不要眼高，最好找个老手细心学一下，光看永远是不行的，最好动手做几次，保证试验操作无误再说。

• lxh031 (2014-5-08 10:15:56)

  谢谢你啊!前两天做了一次,结果失败!有可能是转膜时间短了(105ma,3.5h),也有可能一抗浓度低了(说明书没写建议稀释倍数,我用的1:500),我也不知道是哪里出了问题.结果什么条带都没有!昨晚用30v转过夜(12h),今早来看:凝胶上部的大分子量marker还可看见一点颜色,但是膜上没见转过去的marker!;凝胶下部的小分子量marker都不见了,在膜上能看见最后一条marker带(19kd).这种情况是不是转过头了,如果是的话,那marker的最小的一条带怎么还在膜上呢?请你给点建议,谢谢!

• qhyu (2014-5-08 10:21:03)

  看来是转膜问题！？
  你的转膜效率肯定不对劲！有没有阳性对照？也就是同样条件别人做的结果怎样？
  另外，看Marker不见得准确，还是转膜后用丽春红预染一下，如果条带清晰就能说明转膜效果好。
  附上我收集的一点资料，希望对你有用
  http://www.51protocol.com/pro/WesternBlotting/20070508/28905.html

• xiaoxiaoniao (2014-5-08 10:21:41)

  
  如果怀疑转膜问题，请先说明下面几个问题呵呵
  你的目的蛋白分子量是多少呢？
  转膜仪器的型号？半干转还是湿转呢？
  照小弟看来，如果目的蛋白的分子量在100kd以上，最好用恒流200mA，转2小时，我们实验室用的是北京六一的湿转仪器，跑的蛋白是170KD，以前也是没经验，结果转膜过程中降温措施没搞好，也出现向楼主说的“凝胶上部的大分子量marker还可看见一点颜色,但是膜上没见转过去的marker!;凝胶下部的小分子量marker都不见了,在膜上能看见最后一条marker带(19kd).”类似情况，后来我们把仪器放在冰水里面（转膜槽的3/4都要浸没于冰水中），然后在转膜槽里面再放一个小冰袋降温，转完膜后NC或者PVDF膜上的Marker（from MBI公司）象说明书上画的那么漂亮，洗出来的x片当然效果也不错。
  楼主在注意保证三明治的方向放对的前提下如果解决好降温问题，相信转膜应该不会出问题的！祝你好运！

• lxh031 (2014-5-08 10:22:06)

  我们这没有丽春红，只有再摸条件了！
  

• lxh031 (2014-5-08 10:22:25)

  楼上你也见过这样的现象吗，我还以为只有我才遇到过！我的目的蛋白一个是101kd，另一个是29kd，我们实验室用的是bio-rad的湿转仪，上次转的时候我是放在4度冰箱，并且在负极放了一个冰袋，降温应该没问题。昨天将剩下的凝胶染色，结果被同学仍了，气晕了！现在也不知道是没转过还是转过头了！那这种湿转仪我也能用200ma，2小时吗？今天试试看。

• redbutterfly (2014-5-08 10:22:58)

  
  我觉得最重要的是一抗和二抗的浓度问题．
  首先要看你的一抗效价然后摸条件拉
  还有你的检测系统什么如果是ＥＣＬ的话会敏感的很，如果是ＤＡＢ的话会不敏感