【求助】我要提纯蛋白，透析后上DEAE Sepharose FF结果咨询

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• xue258 (2014-5-09 23:06:01)

  
  我的看法，不一定对。
  一，你的A/B相的放法与众不同，一般做离交都是A低盐，B高盐，你的应该是反其道而行之。所以你求助的话，不明了。
  二，文献中之所以用阶段洗脱的方法是因为以DEAE的分离效果，不足以分离出比活很高的目的蛋白，即无法出现一个目的蛋白的单峰。
  你的图谱虽是单峰，但由于分部收集的洗脱液中的活性并没有如峰形那般规则的正态分布，所以应该是一个“混合峰”。
  我想30mM PBS是洗杂用的，而比活较高的应该分布在100mM的洗脱峰中。
  至于洗脱电导，确实可以通过高比活洗脱液的颠倒来确定。但要注意，GE的系统都有一点死体积，尤其是粗管子的系统。所以要考虑图谱的延时。

• leifengta (2014-5-09 23:06:19)

  
  离子交换层析一般先做一个test，即从低盐到高盐做一个梯度洗脱，然后根据出峰的电导和盐离子浓度确定阶段洗脱的盐离子浓度，这样就可以通过不同盐离子浓度洗脱把目标蛋白和杂蛋白分开，达到分离纯化的目的。
  上图一开始就用高盐溶液洗脱，杂蛋白和目标蛋白一起被洗下来了，所以尽管做的是梯度洗脱，得到的只有一个峰。由于杂蛋白与目标蛋白的洗脱浓度不一样，所以会出现某一管比活很高的结果。
  做test的时候确定盐离子浓度一般以各峰峰尖处的浓度值为准，但如果各峰靠的很紧，就要做适当调整。由于有死体积，所以还要扣除死体积。比如A液盐离子浓度为0%，B液盐离子浓度为100%，电导开始升高时的盐离子浓度8%B，第一个峰的峰尖初的盐离子浓度为38%B，因为电导开始升高证明盐离子开始到检测池，即这时真正的盐离子浓度为0%B，比原来低了8个百分比，那么第一个峰的洗脱浓度应该为30%B而不是38%B。以后的峰依此类推。
  个人经验，仅供参考。如有问题，概不负责。

• duoduo (2014-5-09 23:06:37)

  估计你的A、B液写反了，笔误。
  图谱上上升的斜线应该是Cond。
  如二楼所说，层析系统有延迟体积，为从泵出口到监测池的体积，包括，管道、阀门、梯度混合池、层析柱，以及其它检测流动池，所以目的峰的洗脱盐浓度一定要以检测到的电导来推算。
  根据你所述，建议：
  1，似乎此峰吸附太弱，电导刚上升就开始出峰，不利于分离杂质，可试试提高pH，增加吸附力；
  2，FF型号的胶，用于初步分离，主要目的为快速富集样品，要想提高纯度，可能需要再使用分辨率稍高的型号，如HP等。

• birdfish (2014-5-09 23:08:59)

  
  相关疾病：
  头痛
  姑且不谈，A/B液的正反，我的目的是怎样得到我的最终最适洗脱盐浓度。为这事，我头痛

• bring (2014-5-09 23:09:17)

  不知道你的A液是单独的NaCl，还是B液＋0.5 M的NaCl呢？是否保证两者的pH完全一致，有时候，离子交换配溶液的时候，不能认为加入NaCl并不会改变pH的，需要准确测定
  对于梯度洗脱，一般还是用NaCl来做更好，pbs的浓度不好控制，另外，你的10mM的pb溶液，可能有些低，缓冲能力不够。
  另外，你的吸收峰各步的样品有无跑胶，我想一定不是很纯的蛋白，所以不能单独用活性的高低来作为优化参数的依据
  对于活性而言，需要用比活力，而不是总活力，蛋白浓度高，总活力自然高，这样比较是步准确的。
  你可以把条件做的再细一点，上样量小点，这样在线性梯度洗脱的过程中，容易是目标蛋白和杂蛋白分的更开，如果用1ml预装柱，建议采用50min 0－50％的梯度，然后分管收集，分析，最后再确定阶段梯度洗脱条件
  

• birdfish (2014-5-09 23:09:48)

  QUOTE:

  原帖由 bring 于 2014-5-9 23:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  不知道你的A液是单独的NaCl，还是B液＋0.5 M的NaCl呢？是否保证两者的pH完全一致，有时候，离子交换配溶液的时候，不能认为加入NaCl并不会改变pH的，需要准确测定
  对于梯度洗脱，一般还是用NaCl来做更好，pbs的浓度不好控制，另外，你的10m ...

  谢谢bring。1）我的A液是B液＋0.5 M的NaCl，事先我已经调好A、B的PH=7.0。
  2）一篇文献说用10mM的pb，然后用30mM的pb和100mM的pb洗脱，都得到所要的目的蛋白。
  3）做过电泳的，有6个条带。
  4）比活性，我重复这次实验再做比活性。
  5）上样量只有2mL 。50min ，那多少ml/min收集为好呐？（我以前是1ml/管/min）

• vtongli (2014-5-09 23:10:15)

  
  我想请问下，做ＴＥＳＴ的时候，主要该怎么确定洗脱的浓度呢？？