【求助】跑western胶时～～

最新回复

• tewank (2014-5-09 23:11:18)

  
  破菌不好！样品相互穿孔了引起的。
  破菌样品做WB，封闭可以提高点，抗体标记比例可以放大。尽量减少非特异性染色

• prettygirl@ (2014-5-09 23:11:37)

  
  我没有转膜，只是用考马斯亮兰染了下色。
  为什么样品回互相穿孔呢？
  我是按照分子克隆上给的protocol裂解细菌的，先高速离心一分钟，再用SDS上样buffer重悬煮沸3分钟，再离心1分钟后，上样。这样可以吗？

• leifengta (2014-5-09 23:11:53)

  
  应该是制样的问题
  觉得煮3分钟太短了饿，我们蛋白样最少煮15分钟
  裂解细菌有人经常煮两三个小时

• nikun230 (2014-5-09 23:12:10)

  你在倒胶的时候一定要混匀，同时玻璃板也都要洗干净后尽量凉干，保证分离胶浓度一致。同时在加样的时候每加完一个泳道，要将加样枪完全洗干净，避免上一个泳道的样品带到下一个泳道，造成泳道间样品污染！

• 兔纸 (2014-5-09 23:12:44)

  QUOTE:

  原帖由 prettygirl@ 于 2014-5-9 23:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  才开始做western胶，请达人指教。
  我是用pet－32 a带的目的基因转化BL21，诱导后裂解细菌，上样跑胶，结果胶上有纵向条带，每条泳道的条带宽窄不一，还有样品散溢到其它泳道的现象（因为发现marker中有其它条带），请问达人是什么原因呀 ...

  纵向条带常常是由于样品中不溶成分引起，离心可以去除之，建议延长离心时间。每条泳道的条带宽窄不一可能是由于某些孔上样的蛋白量过大，至于样品散溢到其它泳道则可能是由于你上样体积过大，要根据你的凝胶厚度和凝胶孔完整性来确定上样体积，通常20微升是不会散溢到相邻孔的，你marker如果没有质量问题的话，marker中其它条带就一定是相邻孔散溢过来的蛋白。

• 101010 (2014-5-09 23:13:01)

  
  各个泳道的样品量最好一致，不足部分用LOADING BUFFER 补齐。