【求助】请看我的western结果，对照出来了...

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-5-10 10:50 作者: youreyes 来源: 分析测试百科网

我的过程大概是：
1，protein extraction: 蛋白是从胎鼠脑组织来的。
2，SDS PAGE: 上样量30微克/孔，上样体积6微升，目的蛋白分子量在17kd左右，用的15%的分离胶，用预染marker。
3，transfer: 电转条件是实验室成熟的条件--25v，2小时20分钟，胶上的预染marker都消失，转到膜上（pvdf）。
4，block: 封闭，5%milk TBST，4度过夜。
5，primary antibody: 将膜剪开分别杂交，室温6小时。
目的蛋白17kd，一抗兔来源，实验室以前有人用过这个抗体，质量很好。1：5000稀释
内对照b-tubulin，也是兔来源的。1：5000稀释
6，TBST洗3次，5min/次。
7，二抗，因为上面两种一抗都是兔来源的，我就把两张半片的膜都放到一起孵了，室温30分钟。 1：5000稀释
8，TBST洗3次，5min/次。
9，ECL 1分钟，转入暗室，压片1分钟-5分钟。
结果是：内对照很好，压片时间长的话，背景也有，但是目的蛋白那半片膜啥都没有，干干净净的，非特异性染色都不见。为什么呢？请大家帮忙分析一下啊
条带是b tubulin，下面干干净净的应该有目的蛋白，至少该有背景阿

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youreyes (2014-5-10 10:50:45)

再来张整体图，划了两个方框，是两张半片膜的位置，下面的膜干干净净，上面还有点背景

72080960.jpg
seagate (2014-5-10 10:51:04)

问: 转膜后，Marker小分子量可见吗？
25V转膜2小时20分时间太长，有可能烧透。
伯乐的操作手册上写，mini gel的话15V, 30min 就可以,我的经验30min太短，45min应该可以。
youreyes (2014-5-10 10:51:25)

你好，marker小分子量可见，最小的marker是10kd，听清楚的。我剪膜是在marker 25kd处剪开的
yyaxw84 (2014-5-10 11:20:49)

再增大上样量试试，呵呵
莲花白 (2014-5-10 11:21:12)

首先感觉你的上样量有点小,其次,我觉得你转膜的电压有点过高了吧.我一般都是12V 3小时最近15V 1小时也转的可以,我一般都是跑12%的胶.孵膜的时候建议你分开,有些蛋白本身就不好出.最好单独孵.
bangqi_k (2014-5-10 11:22:35)

那就怪了，我觉得应该是一抗的问题（失效或稀释度过高），要不就是你的目的蛋白表达量太低检测不到。
baidukk (2014-5-10 11:22:53)

可考虑的因素很多，一点建议：
1.孵育抗体前最好用丽春红染一下膜确定17kd附近有没有条带
1.剪膜的时候最好把35kd附近的条带保留（可能产生二聚体的情况）
2.两张膜一起孵抗体的话要将两张膜的蛋白面（通过预染marker可区分）向外
3.用0.2微米的膜，转膜液里可不加sds，提高甲醇的浓度（20％可）（可减少蛋白的洗脱，增加蛋白和膜的相互作用，有利于小分子蛋白的转移）
4.可加大一抗的浓度和提高上样量试试
youreyes (2014-5-10 11:23:18)

昨天看到这样的结果，我把膜放TBST里洗了洗，然后又加上1抗--只做了有目的蛋白的那半片膜，4度过夜，今早洗3次后，加2抗，30分钟，洗3次，然后ECL，去暗室。。。结果就出来了条带，但是背景很脏，如图
youreyes (2014-5-10 11:24:16)

我觉得是2抗以后，洗得不干净，就又用TBST洗了3次，每次10分钟，ECL, 结果再去压片，还是啥都没有，是因为2抗上酶的活性消失了么？很奇怪阿
BUK (2014-5-10 11:24:34)

“我觉得是2抗以后，洗得不干净，就又用TBST洗了3次，每次10分钟，ECL, 结果再去压片，还是啥都没有，是因为2抗上酶的活性消失了么？很奇怪阿” －－应该是这个样子的。
xevin (2014-5-10 11:24:51)

想问一下，你压完片子之后发现结果不好，就又用TBST洗了3次，二抗已经和显色剂结合了，你再用TBST洗会把显色剂洗掉吗？这种方法本身可行吗？不会影响结果吗？