【求助】转膜时间

最新回复

• misswu61 (2014-5-10 16:30:43)

  
  估计你用的是半干转吧，在恒流的情况下，转膜时间与分子量大小和膜的面积都有关系，55kd的蛋白在200mA一般1小时左右应该差不多，具体你要自己摸索一下。
  祝好运！!

• tangxin_80 (2014-5-10 16:32:10)

  我的转膜液是不含SDS的啊

• misswu61 (2014-5-10 16:32:28)

  
  小分子量的蛋白一般不加sds防止过转，实际上我做实验用的电转液一般都是不加sds，55kd我一般用150mA，1.5小时左右，膜的面积一般20cm2左右，200mA的我没用过，不过理论上1小时左右应该差不多，你可以设一个时间梯度转一下你的蛋白，以胶上残余蛋白（你的目的蛋白大小的位置，从预染marker可看出来）最少及滤纸上转过的最少为标准（从预染marker可看出来）。

• ending (2014-5-10 16:32:59)

  为什么我们实验室的师兄做45KD的蛋白，转膜液用的和我的一样的，可是转膜时间用的是3个小时。这是甚么原因呢，谢谢指教！

• ladyhuahua (2014-5-10 16:33:19)

  
  我的经验：
  1.说实话，转膜时间不太重要，不要太离谱就可以，我200mA-500mA都转过，45min到3小时也转过，基本上都可以
  2.比如楼主的蛋白55kD，用200mA，我一般转2小时，这样转上去的较多.
  3.常看到不少文章说转的久了会转过去，呵呵~，我不知道久是多久，我western做了无数，还没遇到过转过去的.
  4.感觉NC膜要比PVDF好，PVDF转的久了，小分子确实弱，但NC膜，呵呵，结合蛋白能力就是强！我转2小时，400mA左右，10-15kd看得还是很清晰，佩服这样的膜!

• is2011 (2014-5-10 16:33:37)

  你用的是干转吧？
  感觉NC膜要比PVDF好，PVDF转的久了，小分子确实弱，但NC膜，呵呵，结合蛋白能力就是强！我转2小时，400mA左右，10-15kd看得还是很清晰，佩服这样的膜!
  你的NC膜是0.22um的还是0.45um的？

• ladyhuahua (2014-5-10 16:34:28)

  0.2um
  下面是我常用的,从160-10kd都不错,你实验室可参考买下
  cuturl('http://www.pall.com/924_33009.asp')

• ladyhuahua (2014-5-10 16:34:50)

  
  我用的湿转
  我以前用的干转经验:
  1.3明治不必太干.
  2.赶尽气泡
  3.上下滤纸不要接触防止短路.
  4.干转时间是比较关键,不要把膜烧焦,感觉转完打开盖子时闻到有点烧煳的味道,但膜还是白的,没有发黄,这样效果不错,呵呵~

• yonger (2014-5-10 16:35:14)

  
  我作的是caspaes-3，每次转膜低分子量的Marker都非常清晰，35KD条带也很清晰，但是就是检测不到活化的17,19KD条带（CST的抗体，是可以检测到活化带的），Marker可以转过来，那我要的17,19KD的活化带也应该转过来了吧？我用的是0.2UM的NC膜，转膜条件是25V,2h，4度冰箱（作其它指标证明确实存在凋亡），到底是怎么回事呢？ 请大家帮帮我吧！