【求助】关于细菌外膜蛋白种类的问题，谢谢

字体: 小中大 | 打印发表于: 2014-5-10 17:44 作者: 079777chao 来源: 分析测试百科网

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【求助】关于细菌外膜蛋白种类的问题，谢谢

请教大家，我提取了细菌外膜蛋白做了质谱分析，最后结果里面鉴定的蛋白多数都属于酶类，如L-fucose isomerase ，由于我没有查到关于外膜蛋白的书，所以不太明白这个外膜蛋白上面是否存在酶类，希望大家给点意见

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最新回复

duoduo (2014-5-10 17:44:32)

请教楼主，细菌膜外蛋白的提取方法，谢谢！
abc816 (2014-5-10 17:44:54)

我在<现代生化技术>郭勇编著,第二版,科学出版社
p137,大肠杆菌细胞膜的分离
方法如下:
(1)......收集到细菌细胞;
(2)30-50mg湿细胞悬浮在300-500ul的超声buffer(0.01M Tris-HCl,pH7.4; 5mM MgCl2; 50ug/ml RNase; 1mM PMSF)中,冰浴超声(20kHz,150W)破碎细胞;
(3)4度8000rpm高速离心5min,去除未破碎的细胞;
(4)取上清液(溶胞液),4度55000rpm,超速离心45min;
(5)上清为细胞质部分,沉淀为细胞膜成分;
去上清,在细胞膜沉淀中加入300ul Sarkosyl,4度静置20min,使细胞内膜溶解;
(7)4度55000rpm超速离心45min;
沉淀为细胞外膜.
ritou1985 (2014-5-10 17:45:12)

请问提细胞的膜蛋白和细菌一样吗？也可以用楼上的方法？
079777chao (2014-5-10 17:45:32)

A.收集的细菌内加入20mmol/L Tris-HCl（PH 7.3）缓冲液，离心（10000×g，4℃），去上清，再次加入Tris-HCl，如此反复洗涤3次。
B.将菌体重悬于20mmol/L Tris-HCl中，混匀，冰浴下超声破碎细菌（按照50W超声波下，超声8秒，间隔8秒，一种菌株大约需要超声13次），至细菌悬液呈现清澈、透明，菌液从枪头滴下而不粘连。
C.4℃，3000g，10min，室温下离心去除未破碎的细菌，小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。
D.超速离心Ⅰ：将上清置于100000g，4℃超速离心60min后，去除上清（含胞质成分），收集细菌外被成分。
E.用10ml含2%的SLS的Tris-HCl（0.2gSLS溶于10mlTris-HCl），室温温育20-30min。
F.超速离心Ⅱ：将上述重悬物置于70000g，4℃超速离心60min后，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。
G.充分吸除上清，并根据沉淀体积大小，用0.1-0.2ml的双蒸水重悬沉淀物，分装，-70℃保存备用。
我也不知道适合用你的不
079777chao (2014-5-10 17:45:48)

但是我还是不明白细菌外膜蛋白都可以分为哪些蛋白种类，没有查到相关的资料，大家帮忙呀
tuuu2 (2014-5-10 17:46:06)

有一些细菌外膜蛋白的proteomics方面的paper,你可以找来看看对照一下.
鉴定的蛋白多数都属于酶类,因为这类蛋白质可能丰度很高,
如果您的目的蛋白质是跨膜蛋白质,可用高盐or高ph洗脱看看。
079777chao (2014-5-10 17:46:45)

请问楼上，我用串联质谱对细菌外膜蛋白进行了分析，一共找出93种，其中大约有一半以上是一些hypothetical蛋白，然后有二十多种属于酶类，然后剩下的是一些膜蛋白，您看这结果如何，还有您知道这外膜蛋白跟膜相关蛋白有什么关系没，谢谢
tuuu2 (2014-5-10 17:47:10)

这个结果还不错啊~
还是建议你看看相关文章再分析
DONT (2014-5-10 17:47:30)

当然有酶类啊！比如外膜蛋白中就有磷脂酶啊！cuturl('www.cf.ac.uk/biosi/staff/ehrmann/tools/ecce/OthersOM.html')　　或者在GOOGLE中搜索OUTER MEMBRANE PROTEINS ，可以找到有关外膜蛋白的一些数据库，里面有一类就是ENZYME。