【求助】为什么用高保真酶以质粒为模板,PCR出来的...


本人正在构建一个载体,可是用高保真酶以质粒为模板,PCR的产物总是有两个酶切位点不对,请高手赐教!

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  • dog002 (2014-5-16 18:22:35)


    你应该确定以下几个问题:
    1。如果你的酶切位点是在模板质粒上,那么你用的模板一定正确吗?
    2。如果你的酶切位点是从引物引入的,那么你的涉及没问题吗?或者你合成的引物本身就有问题,本人曾经碰到公司给合成的引物中少了或多了碱基的情况。
    3。你可以优化反应体系和反应条件。
    4。不知你说的不对是只测序后的结果吗?如果是也可能是公司测序的问题,这也遇到过。如果是酶切不开,而且你用对了酶切配置体系没问题,则只能是引物中引入的位点序列出了错。
  • zzzz (2014-5-16 18:22:54)


    我的酶切位点在插入片段和载体多克隆位点上各一个,PCR条件已优化过。对了,我可以分别切一下模板质粒和载体,如果都能切开,说明问题出在PCR中。多谢指教!
  • zzzz (2014-5-16 18:23:23)

    搜索后发现这两个酶切位点在模版质粒上都有4-5个,所以这个问题还没解决,继续求救!
  • qianqin1977 (2014-5-16 18:23:41)


    高保真酶也不是100%就保证没有错配碱基的。但你的问题是错配的位置老是相同的话,就得考虑不是引物就是模版了。 如果保证引物ok,建议模版测序,看是不是模版有污染。
  • tieshazhang (2014-5-16 18:24:01)


    如何排除引物的问题呢?
  • remonte (2014-5-16 18:24:21)

    QUOTE:

    原帖由 tieshazhang 于 2014-5-16 18:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    如何排除引物的问题呢?
    这个问题通常比较麻烦
    主要根据再次测序结果是否和原来设计是否一致
    另外对口碑不好的引物 公司 最好远离
  • tieshazhang (2014-5-16 18:24:41)


    再次测序无法验证引物,测序前50bp是测不出来的。除非你双向测,看末尾,但是如果片段很大的话末端测序是不准的。
    引物只能是对照公司给你的单子,看看单子上的引物序列是否和你当初设计的序合成是没问题的。
    对于引物合成的公司,确实需要选择口碑比较好的,比如我们一直用invitrogen的,虽然是大公司,也曾经给我们的引物少合成过碱基,所以对单子非常重要。
    国内公司合成的引物碱基虽然没有问题,但往往溶解以后盐分很高,有时候有还有蛋白的污染,对PCR反应体系影响比较大,建议还是不要用国内公司的引物,不要贪便宜吧。
    只能建议这些了。
  • zzzz (2014-5-16 18:25:02)

    我打算把PCR产物酶切一下来验证模板,但愿能找到原因!