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标题:【求助】为什么用高保真酶以质粒为模板，PCR出来的...

zzzz[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】为什么用高保真酶以质粒为模板，PCR出来的...


本人正在构建一个载体，可是用高保真酶以质粒为模板，PCR的产物总是有两个酶切位点不对，请高手赐教！
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你应该确定以下几个问题：
1。如果你的酶切位点是在模板质粒上，那么你用的模板一定正确吗？
2。如果你的酶切位点是从引物引入的，那么你的涉及没问题吗？或者你合成的引物本身就有问题，本人曾经碰到公司给合成的引物中少了或多了碱基的情况。
3。你可以优化反应体系和反应条件。
4。不知你说的不对是只测序后的结果吗？如果是也可能是公司测序的问题，这也遇到过。如果是酶切不开，而且你用对了酶切配置体系没问题，则只能是引物中引入的位点序列出了错。
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zzzz[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的酶切位点在插入片段和载体多克隆位点上各一个，PCR条件已优化过。对了，我可以分别切一下模板质粒和载体，如果都能切开，说明问题出在PCR中。多谢指教！
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zzzz[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
搜索后发现这两个酶切位点在模版质粒上都有4－5个，所以这个问题还没解决，继续求救！
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qianqin1977[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

高保真酶也不是100%就保证没有错配碱基的。但你的问题是错配的位置老是相同的话，就得考虑不是引物就是模版了。 如果保证引物ok，建议模版测序，看是不是模版有污染。
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如何排除引物的问题呢？
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 tieshazhang 于 2014-5-16 18:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如何排除引物的问题呢？

这个问题通常比较麻烦
主要根据再次测序结果是否和原来设计是否一致
另外对口碑不好的引物 公司 最好远离
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再次测序无法验证引物，测序前50bp是测不出来的。除非你双向测，看末尾，但是如果片段很大的话末端测序是不准的。
引物只能是对照公司给你的单子，看看单子上的引物序列是否和你当初设计的序合成是没问题的。
对于引物合成的公司，确实需要选择口碑比较好的，比如我们一直用invitrogen的，虽然是大公司，也曾经给我们的引物少合成过碱基，所以对单子非常重要。
国内公司合成的引物碱基虽然没有问题，但往往溶解以后盐分很高，有时候有还有蛋白的污染，对PCR反应体系影响比较大，建议还是不要用国内公司的引物，不要贪便宜吧。
只能建议这些了。
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zzzz[使用道具]
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发表于 2014-5-16 18:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我打算把PCR产物酶切一下来验证模板，但愿能找到原因！
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