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【求助】镍柱纯化蛋白的纯度问题
【求助】镍柱纯化蛋白的纯度问题
我用原核表达蛋白质，8M尿素融解包含体，镍柱纯化后，想加到细胞培养液里面去。不知道这样纯化的蛋白质溶液里是否还有LPS之类细菌成分的杂质？因为蛋白的量比较少，不能过滤。不知道有什么方法可以使它更纯一点？
谢谢！
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【求助】镍柱纯化蛋白的纯度问题
【求助】镍柱纯化蛋白的纯度问题
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-17 16:09 作者: kulee 来源: 分析测试百科网
最新回复
lxh031 (2014-5-17 16:10:16)
原核表达的蛋白，量少？不是overexpress的？
再纯的话就是复性后过离子交换柱。以及分子筛。
kulee (2014-5-17 16:10:39)
谢谢
我感觉透析恐怕不能将LPS之类的杂质出去吧？杂质会比蛋白还小吗？
另外，我说量少是指洗脱体积小，如果过0.22微米 的滤膜会有相当一部分粘在膜上。
lxh031 (2014-5-17 16:11:07)
QUOTE:
您说要把纯化后的蛋白溶液直接加到细胞里面去，我想是要看它对细胞生长的影响对吧。所以我说要透析，是因为里面的咪唑肯定对细胞生长有影响。这样就不能确定蛋白的作用了。不知道您的研究目的是不是看这个蛋白对某些细胞的影响。
overexpress的蛋白，量应该不是问题，问题是纯度。感觉单纯镍柱纯化很难得到非常纯的蛋白。到时候投文章可能会认为，结论不严谨。
LPS我不太了解。我认为大部分杂质在纯化时，washing一步应该除掉了。还有，LPS的分子量多大？能否过0.22um的膜？至于过膜你可以稀释后再过。然后再浓缩。
而且我认为关键不在除蛋白以外的杂质，关键在于杂蛋白。
供参考
kulee (2014-5-17 16:11:28)
我是想看蛋白对细胞的影响。
你说有咪唑的问题可以用设对照来解决吧？
另外你认为过镍柱后的洗脱液中杂质主要是杂蛋白，那这样的话透析也无法解决问题啊。用什么方法可以进一步纯化呢>
谢谢1
lxh031 (2014-5-17 16:11:56)
QUOTE:
对照并不能解决所有问题。比如你想看某药物对老鼠生长的影响，而把药物溶在氯仿里，这时候老鼠死了。而氯仿对照的也死了，是不是可以说这个药物对老鼠没有用呢？当然这只是极端的例子。但道理是一样的。另外，及时不造成这种极端情况，有些条件也可能成为多因素效应的一个部分。
无论如何，咪唑留在蛋白里肯定是说不过去的，因为这不是一个技术上的难题，可能会让人认为实验者偷懒
至于如何进一步纯化，我上面已经说了：
Bless
kulee (2014-5-17 16:12:17)
我还有一个问题：我的蛋白是洗脱的同时复性的，如果透析有没有可能又变性了？有的人说有这个危险
lxh031 (2014-5-17 16:12:35)
眯唑洗脱后的蛋白不透析的情况我没听说过。
变性会沉淀的。有这个可能不代表就不去试了，对吧。
既然能在洗脱时复性，我认为透析没有问题。我想，您透析时用的buffer就是不含眯唑的elution buffer吧？这个蛋白不会在眯唑中复性，失去眯唑就变性了吧？
您做原核表达，蛋白应该相对来说很多，不是很娇贵啊。每个蛋白都有自己的特性，不做实验永远都不知道会发生什么。不能象小马过河啊
个人建议，仅供参考
Bless
kulee (2014-5-17 16:13:13)
很不幸，我的蛋白往PBS里透析后变性了。很多蛋白沉淀。
再试试不含咪唑的elution buffer吧。
gogo (2014-5-17 16:13:30)
1. 过镍柱一般请况下是不太可能去除LPS的;一般都是要用去内毒素柱子处理的,或用Triton处理,鲎试剂检测其含量;达标方可以实验;
2. 蛋白透析沉淀,你可在洗脱时不加盐,只含imidizole,透析时注意观察.
kulee (2014-5-17 16:13:51)
gogo (2014-5-17 16:14:11)
洗脱液的成分不能改变? 为什么? 不明白
kulee (2014-5-17 16:14:34)
我担心如果改变洗脱液的盐离子浓度，是不是也要改变slutionA中盐离子浓度，这样会影响复性过程。不知道是不是这样啊？
gogo (2014-5-17 16:14:54)
你可以用Tris(ph8.0) 洗柱,再用含500mM NaCl 的Tris(ph8.0) 洗涤,然后加20mM咪唑进一步洗涤,然后用250mM咪唑,Tris(ph8.0)洗脱就可以.
kulee (2014-5-17 16:15:16)
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