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【求助】用Glutathione Sepharose 4B做蛋白纯化遇到点问题
【求助】用Glutathione Sepharose 4B做蛋白纯化遇到点问题
我用原核表达了一个带GST tag的融合蛋白，用超声裂解后提取了蛋白，但是这个蛋白的可溶性不是很好，并且用SDS-PAGE加考马斯亮蓝染色后发现在目的蛋白分子量的位置还有杂蛋白的存在，所以不能很好的估计蛋白的量。但是做WB已经证实了确实是有我要的融合蛋白的。
现在我在用Glutathione Sepharose 4B做纯化，又遇到一点问题。我在4度下让蛋白和珠子结合4h左右。然后用PBS（pH7.4)、0.1% Triton、0.1mM CaCl2、5mM MgCl2配成洗液，14000g离心2分钟，反复洗三次，洗掉杂蛋白。接着再用PBS(pH8.0)、0.1%Triton、20mM还原型谷胱甘肽配成洗脱液，14000g离心2分钟，反复洗三次，第一次洗之前还在20度水浴中孵育了40分钟。
但是试了几次之后发现：1、总是有一些蛋白不能完全挂上去。2、拿洗脱过之后的珠子跑电泳发现还有两条很顽固的杂带没法洗掉。3、我需要的目的蛋白绝大部分洗不下来。
因为我下面想找和这个融合蛋白相结合的蛋白，还是要用亲和纯化，所以也不能一味地加大还原谷胱甘肽的浓度。
我想如果洗不下来的话，就直接让融合蛋白挂在柱子上与待测的蛋白结合，然后再把结合上去的蛋白弄下来应该就可以得到我要的那个蛋白了吧。
现在的问题就是：1、有什么更好的方法能让我把目的蛋白洗下来并且去掉那两条顽固的杂带呢？为什么会出现那两条杂带？
2、有什么好的方法可以让蛋白和蛋白之间的结合力减弱，这样我就可以把融合蛋白和我需要的靶蛋白分离开了。
谢谢各位了！！
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最新回复
pengke1983 (2014-5-17 17:03:07)
14000g离心2分钟，反复洗三次，洗掉杂蛋白。最好用3-5倍的缓冲液洗3-5次,次数越多杂质洗的越好,样品一定要过滤.PBS(pH8.0)、0.1%Triton、20mM还原型谷胱甘肽配成洗脱液加原型谷胱甘肽后一定要调pH,否则pH变低就洗不下目标蛋白,不知道你的pH对不对,你可以检查一下.GST融合蛋白表达会出现GST表达,所以会出现28KD左右的GST带,所以不是很好解决,还需要进一步纯化,或者用不同浓度的谷胱甘肽做阶段洗脱,结合太牢固也可以缩短填料和样品混合时间,还可以直接用过柱的方法纯化,最好选择Glutathione Sepharose 4FF,载量更高,流速更快.好运.
tuomu45 (2014-5-17 17:03:30)
谢谢楼上的建议！我会去测一下洗脱液的pH值的。
但是我的那两条杂带并不是28KD的GST杂带，分子量大概在40－50KD一条，30－40KD一条，所以始终也想不明白为什么会有这两条带。会不会是蛋白提取或者纯化的过程中，GST脱落后和其他的蛋白又结合了，导致一些杂蛋白也带上了GST tag？
我尝试过在洗杂蛋白的时候加5mM的还原谷胱甘肽，但是那两个杂蛋白还是没法洗掉。
另外还有个问题就是，有什么方法让蛋白与蛋白之间的结合力改变吗？比如原来比较强的，经过一些条件的改变之后变弱了。
pengke1983 (2014-5-17 17:03:51)
此外还可能破碎断裂,长时间放置分解,都可能导致一些片段带GST,或者表达不完全导致杂带,所以最好从样品处理就要避免这些问题,仔细看你写的还发现超声破碎后的样品需要过滤,同时在里面加0.2-0.3M NaCl,这样可以避免因为离子作用导致的杂带.降低亲和力可以改变pH,减少接触时间或者在样品和平衡缓冲液中加低浓度的还原谷胱甘肽就可以.
flower-201 (2014-5-17 17:10:15)
好象洗脱液最好是用Tris配制，PBS 好象效果不好，尝试一下看看！
tuomu45 (2014-5-17 17:10:40)
u234 (2014-5-17 17:11:40)
0.2-0.3M NaCl,这样可以避免因为离子作用导致的杂带.所以样品和平衡缓冲液中都加,抱歉匆忙写错了,已经改正
gogo (2014-5-17 17:14:27)
1.两条杂带可能是你的融合蛋白里目的蛋白不稳定,降解造成的,因为GST是比较稳定的;
2.你的蛋白挂不上及蛋白会洗脱不下来,大部分原因是由于你的蛋白是变复性后的,复性溶液中可能只有10%的折叠正确,那不正确的就挂不上了.
我觉得你还是尽量从蛋白表达上清中纯化你的目的蛋白,还有就是要在4度,加蛋白酶抑制剂(PMSF),以防蛋白降解.
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