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【求助】240KD的蛋白咋就杂不出来了
请教各位牛人，【求助】240KD的蛋白咋就杂不出来了
我做了240 KD的 蛋白 WB， 分离胶6%，转膜1小时，80V,其他操作一样，可是还是白板。
谁做过这莫大的蛋白阿，能否给些指点，是不是转膜时间延长？还是哪里要注意一下。一直做得都是100KD以下的蛋白，结果都还可以，这下分子量大了，做不出来了。
快毕业了，着急啊。
谢谢了
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最新回复
tuuu2 (2014-5-19 16:38:57)
lxh031 (2014-5-19 16:40:23)
60V*3H
家宝也有理呀~~~
DONT (2014-5-19 16:45:26)
点个预染marker，如预染marker大于240的带转膜成功，可排除转膜的问题。个人认为240KD蛋白恒流300mA，1个半小时应该没问题。抗体问题的可能性较大。
mickeylin (2014-5-19 16:45:50)
谢谢楼上各位。
抗体是Santa的，新的。觉得应该没问题，因为做过IH，结果还好。
今天上午看没人回贴，自己摸索着80V1个半小时了，刚看见大家的建议，估计这回又是白板了，呵呵。
下次100V*3H试试吧 。
dog002 (2014-5-19 16:46:12)
QUOTE:
我也在做240KD蛋白的WB， 分离胶6%，转膜4.5小时，80mA恒流,也是白板 ,用过转膜100V,3h，仍然是白板你做的是什么细胞/组织的蛋白？
关注你的结果，交流一下啊
mickeylin (2014-5-19 16:46:34)
明天还想换换条件试试。你转膜100V,3h 怎莫还是白板阿？那我只好30V过夜试试。
我做的是脑胶质瘤U251 细胞系，细胞提的蛋白。想做整合素a5b3的表达。
平常都是做100KD以下的蛋白，80V1小时没问题，这次240KD左右就做不出来了。真急。
欢迎一起讨论，克服这个问题。
ending (2014-5-19 16:46:57)
考虑抗体和蛋白提取（降解和丰度）的问题吧，转膜失败的可能性较小。
IH好使的抗体，不一定WB好使。不一定是你的抗体不work，抗体稀释比例很重要。按照推荐的比例从低稀释倍数开始试，如果背景很高则再稀释使用。压第一张片子就压30分钟以上，因为以前都是白板。
dog002 (2014-5-19 16:47:36)
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我也想换低电压过夜转试试，不过最近要做别的试验，WB要暂停一下了。
继续关注你的结果，祝你好运！
dog002 (2014-5-19 16:48:01)
IH好使的抗体，不一定WB好使。不一定是你的抗体不work，抗体稀释比例很重要。按照推荐的比例从低稀释倍数开始试，如果背景很高则再稀释使用。
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按文献我的目的蛋白丰度不低，抗体做细胞免疫荧光也很好。按推荐比例稀释的抗体，也考虑再降低稀释倍数。
dog002 (2014-5-19 16:48:17)
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压片子是什么东东？——不明白地说
831226 (2014-5-19 16:56:56)
你是用的ECL，曝X光吗？还是直接在膜上显色。如是前者就要叫压X光片呵呵，说的不是很清楚，不好意思
dog002 (2014-5-19 16:57:22)
QUOTE:
呵呵，我一直把压片子这步叫做“曝光”的，现在做多了DAB直接显色，一时间没反应过来，见笑见笑BTW:用于ECL的胶片保质期很绝对吗？实验室有些没开过包装，但过期一年半的胶片（Kodak的），扔了可惜，还能用吗？
49888 (2014-5-19 16:57:43)
你可以先试一下阿，剪一块下来，拿到暗室外面来见一下光，再去显影，定影，如果是块黑板，应该可以再用。另，ecl的敏感度比DAB要高。
dog002 (2014-5-19 16:58:22)
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这个偶还是明白滴，只不过文献里用DAB足够显示出条带，手头上DAB也很方便，所以打算先用这个做显色，实在不行再做ECL。
手里的显影定影试剂和胶片都是过期的，还得重新订试剂配液，麻烦，呵呵。
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